Смейл С.Т., Кадонага Дж. Т.: коровой промотор РНК-полимеразы II. Энн Рев Биохим. 2003, 72: 449-479. 10.1146 / annurev.biochem.72.121801.161520.

PubMed Статья Google Scholar

Дэвидсон Э. Х .: Регуляторный геном: Генные регуляторные сети в развитии и эволюции. 2006, Берлингтон, Массачусетс: Academic Press, 1

Google Scholar

Кэрролл С.Б., Гренье Дж. К., Уэзерби С.Д.: От ДНК к разнообразию: молекулярная генетика и эволюция дизайна животных.2005, Молден, Массачусетс: Blackwell Publishing, 2

Google Scholar

Wray GA: Эволюционное значение цис-регуляторных мутаций. Нат Отзывы Genet. 2007, 8: 206-216. 10.1038 / nrg2063.

Артикул Google Scholar

Berman BP, Nibu Y, Pfeiffer BD, Tomancak P, Celniker SE, Levine M, Rubin GM, Eisen MB: использование кластеризации сайтов связывания фактора транскрипции для идентификации цис-регуляторных модулей, участвующих в формировании паттерна у дрозофилы геном.Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99: 757-762. 10.1073 / pnas.231608898.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Берман Б.П., Пфайфер Б.Д., Лаверти Т.Р., Зальцберг С.Л., Рубин Г.М., Эйзен МБ, Селникер С.Е.: Компьютерная идентификация энхансеров развития: сохранение и функция кластеров сайтов связывания транскрипционных факторов в Drosophila melanogaster и Drosophila pseudoobscura .Genome Biol. 2004, 5: R61-10.1186 / GB-2004-5-9-r61.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Боффелли Д., Маколифф Дж., Овчаренко Д., Льюис К.Д., Овчаренко И., Пахтер Л., Рубин Е.М.: Филогенетическое слежение за последовательностями приматов для поиска функциональных областей генома человека. Наука. 2003, 299: 1391-1394. 10.1126 / science.1081331.

PubMed Статья Google Scholar

Castro B, Barolo S, Bailey AM, Posakony JW: Латеральное ингибирование в пронейральных кластерах: цис-регуляторная логика и подавление по умолчанию с помощью супрессора безволосого. Разработка. 2005, 132: 3333-3344. 10.1242 / dev.01920.

PubMed Статья Google Scholar

Эривес А., Левин М.: Координатные энхансеры имеют общие организационные особенности в геноме Drosophila . Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101: 3851-3856.10.1073 / pnas.0400611101.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Halfon MS, Grad Y, Church GM, Michelson AM: Основанное на вычислениях открытие связанных транскрипционных регуляторных модулей и мотивов с использованием экспериментально подтвержденной комбинаторной модели. Genome Res. 2002, 12: 1019-1028.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Hallikas O, Palin K, Sinjushina N, Rautiainen R, Partanen J, Ukkonen E, Taipale J: Полногеномное предсказание энхансеров млекопитающих на основе анализа сродства связывания транскрипционного фактора. Клетка. 2006, 124: 47-59. 10.1016 / j.cell.2005.10.042.

PubMed Статья Google Scholar

Криван В., Вассерман В.В.: Прогностическая модель регуляторных последовательностей, управляющих печеночно-специфической транскрипцией. Genome Res. 2001, 11: 1559-1566.10.1101 / гр.180601.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Markstein M, Markstein P, Markstein V, Levine MS: Полногеномный анализ сгруппированных дорсальных сайтов связывания идентифицирует предполагаемые гены-мишени в эмбрионе Drosophila . Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99: 763-768. 10.1073 / pnas.0125.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

-7.

PubMed Статья Google Scholar

• 86.

  Rivera-Pomar R, Jackle H: от градиентов до полос в эмбриогенезе Drosophila : заполнение пробелов. Тенденции Genet. 1996, 12: 478-483. 10.1016 / 0168-9525 (96) 10044-5.

  PubMed Статья Google Scholar

• 87.

  Ashe H, Mannervik M, Levine M: пороги передачи сигналов Dpp в дорсальной эктодерме эмбриона Drosophila . Разработка. 2000, 127: 3305-3312.

  PubMed Google Scholar

• 88.

  Lecuit T, Brook WJ, Ng M, Calleja M, Sun H, Cohen SM: два различных механизма формирования паттерна на больших расстояниях с помощью Decapentaplegic в крыле Drosophila . 1996, 381: 387-393.

  Google Scholar

• 89.

  Эш Х.Л., Бриско Дж .: Интерпретация градиентов морфогенов. Разработка. 2006, 133: 385-394. 10.1242 / dev.02238.

  PubMed Статья Google Scholar

• 90.

  Манн Р.С., Кэрролл С.Б.: Молекулярные механизмы функции и эволюции селекторного гена. Curr Opin Genet Dev. 2002, 12: 592-600. 10.1016 / S0959-437X (02) 00344-1.

  PubMed Статья Google Scholar

• 91.

  Prabhakar S, Poulin F, Shoukry M, Afzal V, Rubin EM, Couronne O, Pennacchio LA: Близких сравнений последовательностей достаточно для идентификации цис-регуляторных элементов человека. Genome Res. 2006, 16: 855-863. 10.1101 / гр. 4717506.

  PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

• 92.

  Senger K, Armstrong GW, Rowell WJ, Kwan JM, Markstein M, Levine M: ДНК, регулирующие иммунитет, имеют общие организационные особенности у Drosophila .Mol Cell. 2004, 13: 19-32. 10.1016 / S1097-2765 (03) 00500-8.

  PubMed Статья Google Scholar

• 93.

  Beer MA, Tavazoie S: Прогнозирование экспрессии гена по последовательности. Клетка. 2004, 117: 185-198. 10.1016 / S0092-8674 (04) 00304-6.

  PubMed Статья Google Scholar

• 94.

  GoTermMapper. [http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper]

• 95.

  Berkeley Comparative Genomics Project. [http://hanuman.math.berkeley.edu/genomes/]

• 96.

  Центр секвенирования генома, Медицинский факультет Вашингтонского университета. [http://genome.wustl.edu/]

• 97.

  Agencourt Bioscience Corporation. [http://www.agencourt.com]

• 98.

  Ричардс С., Лю Й., Беттенкур Б.Р., Градеки П., Летовски С., Нильсен Р., Торнтон К., Хубиш М.Дж., Чен Р., Мейзель Р.П. и другие: Сравнительное секвенирование генома Drosophila pseudoobscura : эволюция хромосом, генов и цис-элементов.Genome Res. 2005, 15: 1-18. 10.1101 / гр.3059305.

  PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

• 99.

  Benson G: Поиск тандемных повторов: программа для анализа последовательностей ДНК. Nucleic Acids Res. 1999, 27: 573-580. 10.1093 / nar / 27.2.573.

  PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

Транс- и цис-действующие эффекты Firre на эпигенетические особенности неактивной X-хромосомы

Firre и CrossFirre транскрибируются из Xa

Аллель-специфичное CRISPR / Cas9 редактирование области Firre сделано в клетках Пацки, в которых искаженные XCI и видоспецифичные SNP позволили нам разработать руководства для нацеливания на Xi из BL6 или Xa из Mus spretus ( spretus ) (дополнительные данные 1).Мы выделили одноклеточные клоны с делецией ~ 160 т.п.н. Firre на Xa (Δ Firre ^Xa ), либо делецией ~ 160 т.п.н. Firre на Xi (Δ Firre ^Xi ). ), или инверсия ~ 160 kb Firre на Xi (Inv Firre ^Xi ) (рис. 1a). Делеция локуса Firre на Xa приводила к неопределяемой экспрессии Firre с помощью ОТ-ПЦР, в то время как делеция на Xi не вызывала изменений (рис.1а, б, дополнительные данные 2). Анализ аллель-специфической РНК-seq подтвердил отсутствие транскриптов Firre либо из Xa, либо из Xi в Δ Firre ^Xa , в то время как контрольные локусы ( Dxz4 , Xist ) не показали изменений (дополнительные данные 3).

Рис. 1: Firre и CrossFirre выражаются из Xa.

a Геномное расположение Firre и CrossFirre ( Gm35612 ) на X-хромосоме мыши (UCSC mm10 build 38 браузерных треков).Обратите внимание, что Firre имеет несколько альтернативных транскриптов. Расположение направляющих РНК CRISPR, используемых для редактирования локуса (разрез), и пар праймеров ОТ-ПЦР для специфического обнаружения экспрессии Firre (F / R), нити-специфической экспрессии CrossFirre (F1 / R1) , или специфическая для цепи экспрессия в области перекрытия между Firre и CrossFirre (F2 / R2). b Анализ RT-PCR с использованием пары праймеров F / R обнаруживает экспрессию Firre в WT, Δ Firre , ^Xi и Inv Firre , ^Xi , но не в Δ Firre ^Xa .Экспрессия Firre была измерена в n = 3 биологически независимых образцах на тип клеток. c Анализ секвенирования по Сэнгеру области CrossFirre (F1 / R1) и области перекрытия между Firre и CrossFirre (F2 / R2) подтверждают гетерозиготность SNP (BL6 на Xi и spretus на Ха) в каждой исследуемой области. Геномная ДНК (гДНК) демонстрирует гетерозиготность по SNP, в то время как кДНК демонстрирует экспрессию только из SNP spretus (Xa). d Нитьспецифический анализ CrossFirre и Firre проводили с использованием обратной транскрипции с использованием либо случайных праймеров, либо праймеров F1, R1, F2, R2 с последующей ПЦР с использованием пар праймеров F1 / R1 или F2 / R2. Экспрессия Firre и CrossFirre была измерена в n = 3 биологически независимых образцах для каждого типа клеток. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Наша делеция Δ Firre ^Xa включает антисмысловой транскрипт CrossFirre , который частично перекрывает Firre (рис.1а; Дополнительный рис. 1а) ³⁴ . Обратите внимание, что в отличие от Δ Firre ^Xa , ранее сконструированные делеции Firre в ES-клетках мыши и в мыши KO не включают все CrossFirre ^32,35 . Чтобы проверить экспрессию CrossFirre в отредактированных клетках Патски, мы обработали специфичную для цепи ОТ-ПЦР с использованием праймеров (F1 / R1), фланкирующих область 231 п.н. в середине CrossFirre без перекрытия Firre , и праймеры (F2 / R2), которые фланкируют область 203 п.н., перекрывающую 3′-конец Firre (рис.1а). Для неперекрывающейся области прямые транскрипты CrossFirre , содержащие только SNP от Xa ( spretus ), присутствовали в WT (дикого типа), Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi , но отсутствует в Δ Firre ^Xa (рис. 1в, г). Для перекрывающейся области транскрипты с обоих направлений ( CrossFirre и Firre ), снова содержащие только SNP от Xa ( spretus ), присутствовали в WT, Δ Firre ^Xi и Inv Firre . ^Xi , но отсутствует в Δ Firre ^Xa (рис.1г). Мы не нашли доказательств наличия miRNA в области Firre / CrossFirre с использованием miRNA-seq в WT или Δ Firre ^Xa , что позволяет предположить, что локусы функционируют независимо от пути малой РНК (дополнительные данные 4).

Мы заключаем, что Firre и CrossFirre оба транскрибируются с Ха в клетках Пацки. Обратите внимание, что Firre был первоначально идентифицирован как ген, который избегает XCI у человека и мыши ^20,23,28 . Однако наши текущие результаты и результаты, сообщенные для ES-клеток Firre KO мышей и мышей KO, ясно показывают, что Firre преимущественно экспрессируется из Xa в фибробластах ^32,35 .

Firre действует в транс, чтобы поддерживать PRC2 и h4K27me3 на Xi

Чтобы определить, сконструированы ли какие-либо из аллельных изменений, Δ Firre ^Xa , Δ Firre ^Xi и Inv Xi , влияет на эпигенетические метки на Xi, иммуноокрашивание для h4K27me3, h3AK119ubi и macroh3A.1 проводили в комбинации с Xist RNA-FISH для определения местонахождения Xi. Большинство ядер (95 ± 3%) имело одно облако Xist во всех отредактированных линиях клеток, что указывает на отсутствие разрушения покрытия РНК Xist (рис.2а). Сильный кластер иммуноокрашивания h4K27me3 наблюдался на Xi в 83 ± 2% ядер дикого типа, как и ожидалось. Напротив, только 9 ± 2% ядер с кластером h4K27me3 наблюдались в Δ Firre ^Xa , при этом большинство ядер появлялись равномерно по всей поверхности (Рис. 2b; Таблица 1). Не было никаких доказательств полной потери h4K27me3 над Xi, которая выглядела бы как «дыра» с полным отсутствием иммуноокрашивания. Уровень h4K27me3 во всем Δ Firre ^Xa и ядер WT измеряли в областях за пределами Xi с использованием ImageJ для количественной оценки интенсивности флуоресценции путем нормализации по ДНК или гистону panh5 ³⁶ .Не было обнаружено значительных различий в областях за пределами Xi между Δ Firre ^Xa и WT, но нельзя исключить тонкие или локальные изменения, не обнаруживаемые с помощью иммуноокрашивания (дополнительный рис. 2a, b). Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi ядра сохранили сильный кластер h4K27me3 на Xi, что согласуется с сохранением РНК Firre в этих клетках (рис. 2b). Две другие модификации гистонов, которые, как известно, связаны с XCI, h3AK119ubi и macroh3A.1, не показали изменений в ядрах Δ Firre ^Xa (рис. 2в).

Рис. 2: РНК Firre действует в транс, чтобы поддерживать h4K27me3 на Xi.

a — c Всего более 300 ядер Пацки были оценены для каждого типа клеток в 3 независимых экспериментах; значимость определялась односторонним точным критерием Фишера; гистограммы представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего; масштабные линейки представляют 10 мкм. a Примеры ядер после окрашивания Xist RNA-FISH (зеленый) и Hoechst 33342 (синий).Гистограмма не показывает значительных различий между клеточными линиями. b Примеры ядер после иммуноокрашивания h4K27me3 (красный) и окрашивания Hoechst 33342 (синий). Гистограмма показывает значительно меньшее количество ядер с кластером h4K27me3 в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (значение p = 4,63688e-94), но без изменений в Δ Firre ^Xi или Inv Firre Си . c Примеры ядер после иммуноокрашивания macroh3A.1 или h3AK119ubi (красный) и окрашивания Hoechst 33342 (синий).Гистограммы не показывают существенных различий между типами клеток. d Профили h4K27me3 ChIP-seq считываются вдоль Xi в WT (синий), Δ Firre ^Xa (красный) и log ₂ отношение Δ Firre ^Xa / WT (зеленый). Ящичковые диаграммы (логарифм ₂ ) считываний ChIP-seq h4K27me3 в бинах Xi 100 п.н. показывают значительно более низкую медианную величину в Δ Firre ^Xa (красный) по сравнению с WT (синий) (критерий Вилкоксона: p значение = 2,2 e-16). Прямоугольники разграничивают межквартильный размах (IQR) с медианой; усы ± 1.В 5 раз больше IQR; выбросы обозначены точками. e Гистограммы плотности распределения аллельных пропорций (Xa / (Xa + Xi)) пиков h4K27me3 показывают сдвиг для Х-хромосом из-за более низкого h4K27me3 на Xi в Δ Firre ^Xa (красный) по сравнению с WT (синий) (критерий Вилкоксона: −log10P = inf). f Тепловые карты h4K27me3 ChIP-seq считывает 3 т.п.н. вокруг сайтов начала транскрипции (TSS) генов на Xi в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT. г .Графики метагена средней занятости h4K27me3 в X-связанных генах ((TSS к сайту терминации (TES), не в масштабе)) в Δ Firre ^Xa (Xi красный Xa розовый) по сравнению с WT (Xi синий, Xa фиолетовый). h Гистограммы плотности распределения аллельных пропорций (Xa / (Xa + Xi)) пиков SUZ12 показывают сдвиг для X-хромосом из-за более низкого SUZ12 на Xi в Δ Firre ^Xa (красный) по сравнению с WT (синий) (критерий Вилкоксона: −log10P = 20,98). i Геном отслеживает взаимодействия между hnRNPK, EZh3 и SUZ12 с Firre РНК на основе данных RIP-seq в трофобластах и ​​стволовых клетках эмбриона ^39,40 .

Таблица 1 Процентное соотношение ядер с кластером h4K27me3 на Xi.

Затем были сгенерированы аллель-специфические профили h4K27me3 с помощью ChIP-seq, который продемонстрировал снижение на всей хромосоме Xi в Δ Firre ^Xa (рис. 2d). Потерю h4K27me3 в мутантных клетках количественно оценивали путем подсчета уникальных считываний, картированных на Xa, Xi и аутосомы. В WT отношение чтения Xi / Xa составляло 2,45, что отражает характерное обогащение h4K27me3 на Xi. Напротив, это соотношение было всего 1.60 в Δ Firre ^Xa , что соответствует значительному уменьшению Xi (рис. 2d). Коэффициенты считывания для аутосом у BL6 / spretus и Δ Firre ^Xa оставались аналогичными, 1,04 и 1,14, соответственно. Снижение уровня h4K27me3 на Xi на 34% процентов, измеренное с помощью ChIP-seq, ниже, чем измеренное с помощью иммуноокрашивания (89%), что ожидается на основе известных различий между методологиями. В то время как иммуноокрашивание улавливает конденсацию Xi и, таким образом, приводит к образованию многих ядер с видимым кластером h4K27me3, ChIP-seq выявляет неравномерное распределение h4K27me3 вдоль Xi и, таким образом, очевидно меньшее обогащение ³⁷ .Фактически, изменение на 34% в h4K27me3, которое мы измерили с помощью ChIP-seq в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT, аналогично тому, о котором сообщалось между недифференцированными и дифференцированными ES-клетками мыши, у которых начало XCI вызывает только 40% -ное увеличение. на уровне h4K27me3, как измерено с помощью ChIP-seq, в то время как более 90% ядер приобретают видимый кластер h4K27me3, как определено с помощью иммуноокрашивания ³⁷ .

Затем мы вычислили доли аллелей покрытия чтения SNP для каждого пика h4K27me3, покрытого как минимум пятью чтениями SNP.Как в WT, так и в Δ Firre ^Xa распределение пропорций аллелей ( spretus / ( spretus + BL6)) для аутосом сосредоточено близко к ожидаемому 0,5, что отражает аналогичное обогащение между аллелями (рис. 2e). . Напротив, распределение аллельных пропорций для X-хромосом (Xa / (Xa + Xi)) с центром на уровне ~ 0,35 в WT, что согласуется с обогащением h4K27me3 на Xi, но было заметно сдвинуто в сторону более высоких значений (~ 0,5) в Δ . Firre ^Xa , что подтверждает снижение h4K27me3 на 34% на Xi (рис.2д). Тепловые карты и метагеновые графики аллельных данных ChIP-seq дополнительно демонстрируют драматическую потерю h4K27me3 вокруг сайта начала транскрипции и по всему телу X-сцепленных генов в мутантных клетках (Fig. 2f, g). Повторы LINE и SINE также показывают более низкий h4K27me3 на Xi в Δ Firre ^Xa (дополнительный рис. 2c). Наконец, мы подтвердили уменьшение h4K27me3 в Δ Firre ^Xa с помощью CUT & RUN в отдельном исследовании ³⁸ .

Затем мы исследовали SUZ12, субъединицу комплекса PRC2, используя CUT & RUN, который показал уменьшение Xi в Δ Firre ^Xa .Опять же, распределение пропорций аллелей (Xa / (Xa + Xi)) для каждого пика SUZ12 показало выраженный сдвиг в сторону более высоких значений (~ 0,75) для X-хромосом в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT, тогда как пропорции аллелей для аутосомы (0,5) не изменились (рис. 2h). Повторный анализ опубликованных наборов данных о взаимодействиях РНК / белок в клетках мыши подтвердил взаимодействие Firre РНК с компонентами PRC. Анализ данных RIP-seq показал взаимодействия РНК Firre с двумя компонентами PRC2, EZh3 и SUZ12, а также с hnRNPK, белком, рекрутирующим неканонический PCGF3 / 5-PRC1 (рис.2i; Дополнительные данные 5) ^39,40 . Анализ данных, полученных с помощью CLIP-seq и PAR-CLIP, двух методов УФ-кросслинкинга для высокоточного картирования взаимодействий РНК-белок, подтвердил взаимодействия Firre РНК с EZh3 и обнаружил взаимодействия с JARID2 и RBFOX2, двумя белками, известными для помогают рекрутировать PRC2 в хроматин и с CBX7, компонентом канонического комплекса PRC1, участвующим в отложении h4K27me3 ^{41,42,43,44,45} (Supplementary Data 5).

Мы пришли к выводу, что РНК Firre , транскрибируемая с Xa, специфически помогает нацеливать комплексы PRC1 и PRC2 на Xi для поддержания h4K27me3, что согласуется с транс-действующим эффектом в клетках Патски.В подтверждение мы находим, что некоторые белки, участвующие в комплексах PRC, являются интеракторами РНК Firre .

Дозозависимые и клеточно-специфические эффекты

Firre

Чтобы количественно оценить эффекты Firre , мы подавили его дозозависимым образом, используя shRNA и siRNA обработки независимого изолята Patski для достижения уровней KD в диапазоне от 43, 28 и 10% от WT. Это вызвало параллельное снижение процента ядер с кластером h4K27me3 до 33%, 27% и 15% соответственно по сравнению с 83% у WT ( p <0.0001) (рис. 3а; таблица 1). Важно отметить, что это выявляет дозозависимый эффект РНК Firre на обогащение h4K27me3 на Xi (рис. 3a). Одновременно дозозависимое увеличение РНК CrossFirre обратно коррелирует с количеством РНК Firre , что соответствует репрессии антисмыслового транскрипта Firre (фиг. 3b).

Фиг. 3. Дозозависимые эффекты РНК Firre на h4K27me3 на Xi в клеточных линиях и in vivo.

a Процент ядер с кластером h4K27me3 после KD в клетках Пацки относительно уровня экспрессии Firre , измеренного с помощью qRT-PCR в n = 3 биологически независимых образцах.Данные представлены как средние значения ± SEM. b Уровень экспрессии CrossFirre обратно пропорционален уровню экспрессии Firre после Firre KD. Экспрессия, измеренная с помощью qRT-PCR, в n = 3 биологически независимых образцах. Данные представлены как средние значения ± SEM. c, d Всего более 300 ядер Пацки были оценены для каждого типа клеток в трех независимых экспериментах; значимость определялась односторонним точным критерием Фишера; гистограммы представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего; масштабные линейки представляют 10 мкм. c Столбиковые диаграммы показывают значительно меньше кластеров h4K27me3 после Firre KD в ядрах из трех первичных MEF по сравнению с имитацией обработки (значение p = 2,89075e-12, 1,41519e-32 и 8,95838e-10, соответственно). Первичные MEF были получены от эмбриона (BL6 × spretus ) с spretus Xi и от эмбрионов (BL6 × spretus ) или (BL6 × castaneus ) со случайным XCI (Таблица 1). d Столбчатые диаграммы показывают более низкий (но не значительный) процент кластера h4K27me3 в ядрах из MEF, полученных от Firre ^+/- и Firre ^{— / —} KO эмбрионов, чем в контроле (значение p = 0.0774 и 0,0567 соответственно). Не было обнаружено значительных различий в мозге, печени и почках у мышей Firre KO по сравнению с WT (значение p = 0,9127, 0,8796 и 0,762, соответственно). e Профили h4K27me3 ChIP-seq считываются вдоль Х-хромосом от CLP и CD8 + Т-клеток от WT (синий), Firre ^{— / —} (красный) и log ₂ отношение Firre ^{— / —} / WT (зеленый) показывают значительное уменьшение, охватывающее ~ 26 Mb вокруг локуса Firre в мутантных CLP, и, в меньшей степени, CD8 + Т-клетки (дополнительные данные 6). f Тепловые карты считываний ChIP-seq h4K27me3, расположенных в 3 т.п.н. вокруг сайтов начала транскрипции (TSS) X-связанных генов, которые картируются в области 26 Mb около Firre в WT и Firre ^{— / —} CLP и CD8 + Т-клетки.

Отдельный KD для истощения РНК Firre до 33% WT в первичных эмбриональных фибробластах мыши (MEF), независимо полученных от эмбриона BL6 × spretus F1 со случайным XCI, значительно снизил процент ядер с кластером h4K27me3 до 43 % по сравнению с 79% в контроле ( p <10 ⁻⁴ ) (рис.3c; Таблица 1). Чтобы исключить видоспецифические эффекты, мы протестировали MEF из эмбриона BL6 × spretus F1 с паттерном XCI, противоположным таковому в клетках Пацки (т.е. Xi от spretus ), и MEF от BL6 × castaneus Эмбрион F1. После KD в этих линиях уровень РНК Firre был снижен до 21 и 15% от WT, что привело к значительному сокращению до 45 и 47% ядер с кластером h4K27me3, по сравнению с 80 и 78% в контроле, соответственно ( p <10 ⁻⁴ ) (рис.3c; Дополнительный рис. 2d; Таблица 1). В этих линиях не было обнаружено значительных изменений в CrossFirre (дополнительный рис. 2e). Затем мы исследовали клетки и ткани мыши Firre KO модели ^32,33 . MEF из гетерозиготных ( Firre ^+/- ) и гомозиготных ( Firre ^{— / —} ) эмбрионов KO женского пола показали умеренное сокращение до 43 и 41% ядер с кластером h4K27me3, соответственно, по сравнению с 58%. у контрольного однопометника ( Firre ^{+ / +} ) (рис.3d; Таблица 1). Иммуноокрашивание h4K27me3 в срезах печени, почек и мозга, полученных от самок мышей Firre ^{— / —} , не показало значительного уменьшения ядер с кластером (рис. 3d; таблица 1).

Затем мы выполнили анализ h4K27me3 ChIP-seq отсортированных CLP и CD8 + Т-клеток, полученных от самок мышей Firre ^{— / —} KO. Неожиданно мы обнаружили поразительную потерю h4K27me3 в области размером ~ 26 Mb (ChrX: 36–62 Mb), сосредоточенной вокруг локуса Firre , вместе с небольшим уменьшением по всей X-хромосоме, но не по аутосомам (рис.3e, дополнительный рис. 3a, b). Тепловые карты контроля и Firre ^{— / —} KO CLP и CD8 + Т-клетки показали потерю h4K27me3 вокруг сайта начала транскрипции генов, расположенных в этой области размером 26 Mb (рис. 3f, дополнительные данные 6). Хотя мы предполагаем, что эта локальная потеря h4K27me3 влияет на Xi, а не на Xa, аллельный анализ был невозможен, поскольку мыши KO являются гомозиготными BL6. Область размером 26 Mb около Firre содержит 266 курируемых генов, 15 из которых участвуют в иммунитете (например,g., Nkap, Sash4, Atp11c , Sh3d1a , Elf4 ^46,47,48 ) и 15, потенциально проявляющие эффекты гаплонедостаточности у человека (например, GPC3 ⁴⁹ ) (дополнительные данные 6) . Однако не сообщалось о специфических изменениях экспрессии любого из этих генов в CLP от мышей KO ³³ .

Таким образом, мы обнаружили дозозависимый эффект РНК Firre в поддержании h4K27me3 на Xi в нескольких типах фибробластов.Отсутствие обнаруживаемых изменений в трех тканях мышей Firre KO предполагает, что роль Firre может быть специфичной для клеточного типа и ткани, как это предполагается для других lncRNAs ⁵⁰ . В соответствии с ролью Firre в гематопоэзе, локальные изменения наблюдались в CLP и CD8 + Т-клетках вокруг локуса Firre , выявляя типоспецифичную роль в цис-поддержании h4K27me3 ³³ .

Спасение h4K27me3 на Xi

трансгенами кДНК Firre / FIRRE

Для подтверждения причинной роли РНК Firre в обогащении h4K27me3 на Xi, Δ Firre ^{были трансфицированы клетками Xa мыши Firre Xa Трансген кДНК} , в котором отсутствуют первые пять 5′-экзонов Firre и экспрессируется с промотора CMV (дополнительный рис.1б). Посредством RNA-seq экспрессия Firre восстанавливалась до почти нормального уровня после трансфекции. Эктопическая экспрессия кДНК мыши в клетках Δ Firre ^{Xa + mtransgene} спасала присутствие кластера h4K27me3 от 9 до 38% ядер, поддерживая транс-действующую роль (рис. 4a, b, таблица 1). Это частичное спасение нелегко объяснить гетерогенными уровнями трансгена среди клеток, поскольку клонированная трансгенная линия со стабильно высокой экспрессией Firre восстановилась до аналогичного уровня (34%). Firre RNA-FISH в этом клоне показала ассоциацию днРНК с облаком Xist в 15% клеток, что соответствует частичному спасению (фиг. 4c). Неполное восстановление, вероятно, связано с частичным трансгеном кДНК, в котором могут отсутствовать функциональные мотивы РНК, изоформы и регуляторные элементы (дополнительный рис. 1b). Интересно, что мы также наблюдали частичное восстановление после эктопической экспрессии кДНК человека FIRRE в клетках Δ Firre ^{Xa + htransgene} (рис. 4a, b; таблица 1).Затем мы исследовали MEF Firre ^+/- и Firre ^{— / —} от мышей KO с индуцируемой эктопическим доксициклином (DOX) плазмидной копией полной кДНК Firre , интегрированной в геном. После индукции экспрессии Firre (10-20 раз) было обнаружено сильное увеличение до 91 и 83% ядер с кластером h4K27me3 по сравнению с 43 и 41% в неиндуцированных KO-клетках, соответственно (рис. 4d; таблица 1).

Рис. 4. Эктопическая экспрессия РНК Firre / FIRRE частично восстанавливает h4K27me3 на Xi.

a Примеры ядер после иммуноокрашивания h4K27me3 (красный) и окрашивания Hoechst 33342 (синий) в WT, Δ Firre ^Xa и Δ Firre ^Xa , трансфицированных мышью Firenere Firre ^{Xa + mtransgene} ) или человеческий трансген FIRRE (Δ Firre ^{Xa + htransgene} ). b Гистограмма показывает значительно более высокий процент ядер с кластером h4K27me3 в клетках с трансгеном Firre / FIRRE мыши или человека по сравнению с Δ Firre ^Xa (значение p = 2.8075e-16 и 0.0000134599 соответственно). c Примеры ядер после РНК-FISH для Xist (зеленый) и Firre (красный) в клоне клеток Δ Firre ^{Xa + mtransgene} с высокой экспрессией трансгена мыши. Два верхних ядра показывают ассоциацию между сигналами Firre и Xist (наблюдаются в 15% ядер), а нижние ядра — отсутствие ассоциации. d Гистограмма показывает процент ядер с кластером h4K27me3 в MEF, происходящих от Firre ^+/- и Firre ^{— / —} самок, несущих доксициклин (Dox) индуцибельный трансген ( Firre 90 ^+/− тг; rtTA; -Dox; Firre ^+/− тг; rtTA; + Dox; Firre ^{— / —} тг; rtTA; -Dox; Firre ^{— / —} tg; rtTA; + Dox) по сравнению с WT и мутантами.Процент ядер с кластером h4K27me3 значительно увеличивается в Firre ^+/- tg; rtTA и Firre ^{— / —} tg; rtTA MEF после добавления доксициклина (Dox +) (значение p = 4,31567e-30 и 3.51193e-20 соответственно). Всего более 300 ядер, оцененных на наличие кластера h4K27me3 ( a , b, d ) или на Xist и Firre сигналов РНК-FISH ( c ) на тип клетки в течение трех независимых эксперименты; значимость определялась односторонним точным критерием Фишера; гистограммы представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего; масштабные линейки представляют 10 мкм.

Мы пришли к выводу, что потеря h4K27me3 на Xi в мутантных клетках может быть восстановлена ​​трансгеном кДНК, поддерживая транс-действующую роль Firre . Неожиданно, человеческий трансген FIRRE также может до некоторой степени спасать, что предполагает функциональную совместимость между видами, несмотря на дивергенцию последовательностей. Результаты индукции трансгена в модели KO мышей дополнительно подтверждают дозозависимый транс-эффект РНК Firre на обогащение h4K27me3 на Xi.

Firre действует in trans, чтобы поддерживать ядерную локализацию Xi

Далее мы исследовали эффекты аллельных мутаций Firre на местоположение Xi относительно ядрышка и пластинки.В WT использовали иммуноокрашивание Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi h4K27me3 и нуклеофозмин (NPM1) для определения местонахождения Xi и ядрышек (фиг. 5a). Поскольку кластер h4K27me3 скомпрометирован в Δ Firre ^Xa , Xist RNA-FISH применяли в сочетании с иммуноокрашиванием NPM1. Расположение Xi оценивалось в ядрах WT как смежное с периферией ядра (70%), поверхностью ядрышка (50%) или ни с одной из них (8%) (рис.5б). Обратите внимание, что в 28% ядер Xi находился близко как к периферии, так и к ядрышку. Потеря РНК Firre в Δ Firre ^Xa вызвала значительное сокращение ассоциаций Xi-ядерной периферии и Xi-ядрышек до 20 и 22% ядер, соответственно ( p <0,0001) (рис. 5b). Важно, что эктопическая экспрессия трансгена кДНК в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} значительно (но не полностью) спасает эти ассоциации (рис. 5b).Удаление или инверсия Firre на Xi не изменило его расположение (рис. 5a, b). В первичных MEFs, независимо полученных от BL6 × spretus F1 мыши со случайным XCI Firre KD, также вызывает снижение Xi-ядерной периферии и Xi-ядрышковых ассоциаций (Fig. 5c).

Рис. 5: Firre РНК действует в транс, чтобы поддерживать положение Xi.

a — c Всего более 300 ядер на тип клетки в 3 независимых экспериментах были оценены для местоположения Xi, отмеченного кластером h4K27me3 или облаком Xist , относительно периферии ядра или ядрышка; значимость определялась односторонним точным критерием Фишера; гистограммы представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего; масштабные линейки представляют 10 мкм. a Примеры ядер после иммуноокрашивания h4K27me3 (красный) для определения местоположения Xi в WT, Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi или Xist RNA-FISH (красный) для определения местоположения Xi в Δ Firre ^Xa , поскольку в этих ядрах нет кластера h4K27me3. Ядра также были иммуноокрашены на NPM1 (зеленый), чтобы определить местонахождение ядрышка. b Столбчатые диаграммы показывают значительное уменьшение ассоциации Xi с периферией и ядрышком в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (значение p = 3.95632e-40 и 3.75497e-14 соответственно), но без значительных изменений в Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi (значение p = 0,6968). Эктопическая экспрессия мышиного трансгена в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} частично восстанавливает положение Xi до 41% на периферии и 34% в ядрышке (значение p = 6,62701e-10 и 0,000265481, соответственно). c Столбчатые диаграммы показывают значительное снижение ассоциации Xi с периферией и ядрышком после Firre KD в первичных MEF, полученных от эмбриона F1 (BL6 × spretus ) (значение p = 1.13757e-09 и 0.0000634923 соответственно). d Гистограммы плотности распределения аллельных пропорций (Xa / (Xa + Xi)) пиков CTCF показывают сдвиг в распределении для X-хромосом из-за уменьшения CTCF на Xi в Δ Firre ^Xa (красный) по сравнению с WT (синий). В Δ Firre ^{Xa + mtransgene} (коричневый) это распределение становится биномиальным из-за частичного восстановления CTCF на Xi. e Графики Xi-ассоциированной (общей + Xi-специфической) пиковой плотности CTCF (отсчеты сгруппированы в окнах 100 кб) вдоль Xi для WT (синий) и Δ Firre ^Xa (красный).Чтобы учесть различия в количестве пиков, покрытых SNP, из-за глубины секвенирования, объединенные подсчеты масштабируются с помощью коэффициента, полученного из соотношений между выборками пиков, покрытых аутосомными диплоидными SNP.

CTCF участвует в ассоциации ядрышек геномных областей, и мы ранее показали, что Ctcf KD снижает ассоциации Xi-ядрышек в клетках Пацки ^20,51 . Здесь мы профилировали аллельное связывание CTCF с помощью CUT & RUN, которое продемонстрировало потерю связывания CTCF на Xi в Δ Firre ^Xa (рис.5г). Распределение пропорций аллелей (Xa / (Xa + Xi)) для пиков CTCF на X-хромосомах показало выраженный сдвиг в сторону более высоких значений (~ 0,85) в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (~ 0,65), в то время как аллельный пропорции ( spretus / ( spretus + BL6)) для аутосом были близки к ожидаемым 0,5 (рис. 5d). Таким образом, хотя связывание CTCF на Xi меньше, чем на Ха у WT, как и ожидалось, связывание CTCF еще ниже у Δ Firre ^Xa (рис.5д). В Δ Firre ^{Xa + mtransgene} распределение аллельных пропорций для X-хромосом становится биномиальным, указывая на частичное восстановление CTCF на Xi (рис. 5d).

Взятые вместе, наши результаты показывают, что Firre РНК, транскрибируемая с Xa или с эктопического трансгена кДНК, может влиять в транс положении Xi в ядре. Наши результаты также предполагают потенциальное сотрудничество между Firre РНК и CTCF в поддержании положения Xi.

Потеря

Firre влияет на экспрессию гена в клетках Пацки

Затем мы исследовали изменения в общей экспрессии генов (аутосомные и Х-сцепленные гены без различения аллелей) в Δ Firre ^Xa . Примерно 11 и 14% генов с экспрессией ≥1TPM по крайней мере в одном состоянии были активированы и подавлены в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT, соответственно (дополнительные данные 7 и 8). Большая часть (46 и 40% соответственно) дисрегулируемых генов была спасена в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} (рис.6a, b, дополнительный рисунок 4a, дополнительные данные 7). Чтобы исключить эффекты анеуплоидии между клеточными линиями, результаты были подтверждены для генов, расположенных на диплоидных хромосомах у WT и Δ Firre ^Xa (дополнительный рис. 4b, дополнительные данные 9). Анализ GO показывает, что 20 основных терминов GO для генов, активируемых в Δ Firre ^Xa и спасенных в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} , связаны с клеточным циклом, репликацией ДНК, сегрегацией хромосом и функцией иммунных клеток, в то время как гены с пониженной регуляцией участвуют в развитии, дифференцировке и метаболизме (рис.6а, б; Дополнительные данные 10). В человеческих клетках HEK293 FIRRE РНК KD приводила к дозозависимой гибели клеток, что согласуется с ролью в росте и выживании клеток (дополнительный рис. 4c).

Рис. 6. Потеря РНК Firre влияет на экспрессию гена.

a Гены с усиленной регуляцией в Δ Firre ^Xa и обогащение терминов Gene Ontology (GO). Диаграмма Венна показывает количество активированных генов в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT и в Δ Firre ^Xa по сравнению с Δ Firre ^{Xa + mtransgene} , при этом набор перекрывающихся генов представляет собой набор перекрывающихся генов. Firre ^Xa , которые восстанавливаются экспрессией трансгена.На диаграмме разброса показаны гены с нарушенной регуляцией в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (серый), при этом гены спасены за счет снижения экспрессии в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} по сравнению с Δ Firre ^{Xa более чем в 2} раз ( ; p значение <0,05 по критерию Вальда) выделены оранжевым цветом. Перечислены 20 основных условий GO перекрывающихся генов с усиленной регуляцией в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT, которые восстанавливаются в Δ Firre ^{Xa + мтрансген} .Ось X указывает FDR (-log10). b Гены с подавлением экспрессии в Δ Firre ^Xa и обогащение терминов Gene Ontology (GO). Диаграмма Венна показывает количество генов с пониженной регуляцией в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT и в Δ Firre ^Xa по сравнению с Δ Firre ^{Xa + mtransgene} , набор перекрывающихся генов представляет собой набор перекрывающихся генов . Firre ^Xa , которые восстанавливаются экспрессией трансгена.На диаграмме разброса показаны гены с нарушенной регуляцией в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (серый), при этом гены спасены за счет увеличения экспрессии в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} по сравнению с Δ Firre ^{Xa более чем в 2} раз ( ; p значение <0,05 по критерию Вальда) выделены синим цветом. Перечислены 20 основных условий GO перекрывающихся генов с пониженной регуляцией в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT, которые восстанавливаются в Δ Firre ^{Xa + мтрансген} .Ось X указывает FDR (-log10). c Xi-экспрессия кратных изменений для генов, которые подвержены или ускользают от XCI между Δ Firre ^Xa и WT. Активированные гены показаны красным, а гены с пониженной регуляцией — зеленым. Следует отметить, что один активированный ген и один ген, подверженный XCI, выделены серым цветом, поскольку они показали более чем 2-кратное изменение экспрессии, но со значением p > 0,05 по тесту Вальда в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT. . Гены расположены от центромеры к теломере вдоль Xi.

Чтобы определить, была ли нарушена экспрессия гена на Xi при потере РНК Firre , мы оценили экспрессию аллельного гена. Только 6/352 генов, которые, как известно, подвержены XCI, показали> 2-кратную активацию в Δ Firre ^Xa , что указывает на незначительную реактивацию Xi (фиг. 6c, дополнительные данные 3 и 7). Четыре реактивированных гена были расположены на теломерном конце Xi, где более высокая доступность и меньшая плотность контактов наблюдались для ATAC-seq и Hi-C (см. Ниже).Хотя их количество невелико, и мы не можем исключить случайное возникновение, больше генов, которые, как известно, избегают XCI, подвергались дисрегуляции (10–14%) от Xi, чем гены, подверженные XCI (2–3%) (рис. 6c, дополнительный рис. 4d, дополнительные данные 7). Большинство дисрегулируемых X-сцепленных генов (67%) были спасены в Δ Firre ^{Xa + mtransgene} (дополнительный рис. 4e, дополнительные данные 3 и 7).

Метагеновые графики h4K27me3 вдоль аутосомных и X-сцепленных генов, сгруппированные на основе изменений их экспрессии в Δ Firre ^Xa , вместе с профилями отдельных генов показали небольшое увеличение h4K27me3 для генов с пониженной регуляцией и очень небольшое изменение или отсутствие изменений для активированных или неизмененных генов (дополнительный рис.5а, б). Обратите внимание, что 90% генов с нарушенной регуляцией не содержат обогащения h4K27me3 ни WT, ни Δ Firre ^Xa . Дополнительный анализ CUT & RUN двух активных эпигенетических меток, h4K36me3 и h4K4me3, не показал значительных изменений Xi в Δ Firre ^Xa , что согласуется с небольшой реактивацией Xi (дополнительный рис. 5c, d)

Таким образом, потеря РНК Firre вызывает широко распространенные изменения в экспрессии генов, в значительной степени спасаемые трансгеном кДНК.Очень небольшая реактивация и незначительные изменения в генах ускользания происходят на Xi, несмотря на наблюдаемую потерю h4K27me3, что согласуется с этой эпигенетической меткой, представляющей только один слой контроля XCI ²⁰ .

Аллельные изменения локуса

Firre изменяют структуру Xi

Мы оценили доступность хроматина у мутантов Firre с помощью ATAC-seq. Как и ожидалось, у WT распределение пропорций аллелей было сосредоточено на 0,5 для аутосом, но было смещено в сторону Xa (0.95) для X-хромосом, что указывает на доступность нижнего хроматина на Xi. Этот образец оставался аналогичным в Δ Firre ^Xa , что соответствовало практически отсутствию реактивации гена. Графики пиковой плотности ATAC дополнительно отражают профили низкой доступности Xi как в WT, так и в Δ Firre ^Xa (рис. 7a, b). Однако более высокая пиковая плотность наблюдалась в теломерной области Xi в Δ Firre ^Xa , где расположены реактивированные гены (рис.6c; 7в). Паттерны ATAC-seq не изменились в Δ Firre ^Xi и Inv Firre ^Xi (дополнительный рис. 6a, b). Чтобы определить, могут ли Dxz4 и Firre иметь синергетические цис-эффекты на доступность хроматина на Xi, ATAC-seq выполняли на линии с двойным мутантом Δ Firre ^Xi / Δ Dxz4 Xi Xi . Интересно, что выраженный сдвиг в сторону более низких значений в распределении пропорций аллелей для Х-хромосом (пик на ~ 0.55) наблюдалась у этого двойного мутанта по сравнению с Δ Dxz4 ^Xi (пик ~ 0,85) или Δ Firre ^Xi (пик ~ 1), что указывает на повышенную доступность хроматина на Xi (рис. 7г, д).

Рис. 7. Доступность хроматина после делеций аллеля Firre и делеции Firre / Dxz4 .

a Гистограммы плотности распределения аллельных пропорций ( spretus / ( spretus + BL6)) пиков ATAC вдоль аутосом и Х-хромосом для WT (синий) и Δ Firre ^Xa ( красный).Сдвига не наблюдается (критерий Вилкоксона: -log10P = 32). б . Процентные доли пиков ATAC вдоль аутосом и Х-хромосом, классифицированных как spretus -специфические, BL6-специфичные или оба, не показывают различий между WT (синий) и Δ Firre ^Xa (красный). с . Графики Xi-связанной (общей + Xi-специфической) пиковой плотности ATAC (отсчеты, объединенные в окнах 500 kb) вдоль Xi показывают повышенную доступность на теломерном конце Xi в Δ Firre ^Xa (красный) по сравнению с WT ( синий).Чтобы учесть различия в количестве пиков, покрытых SNP, между образцами из-за глубины секвенирования, объединенные подсчеты масштабируются с помощью коэффициента, полученного из соотношений между образцами пиков, покрытых аутосомными диплоидными SNP. d Гистограммы плотности распределения аллельных пропорций ( spretus / ( spretus + BL6)) пиков ATAC показывают сдвиг в сторону более низкого отношения Xa / (Xa + Xi) у двойного мутанта Δ Firre ^Xi / Δ Dxz4 ^Xi (фиолетовый), по сравнению с Δ Dxz4 ^Xi (черный) и Δ Firre ^Xi (зеленый), что соответствует повышенной доступности на Xi: тест Вилкоксона −log10P = 35). e Доля пиков ATAC в Δ Dxz4 ^Xi (черный), Δ Firre ^Xi (зеленый) и Δ Firre ^Xi / Δ Dxz4 908 аутосомы и Х-хромосомы, классифицируемые как spretus, -специфичные, BL6-специфические, или оба, показывают увеличение BL6 Xi у двойного мутанта.

На основании аллель-специфичных контактных карт высокого разрешения, созданных ДНКазой Hi-C, двудольная структура Xi сохранялась в Δ Firre ^Xi , но контакты между супердоменами увеличивались и уменьшались внутри каждого супердомена, что позволяет предположить, что Firre Локус действует в цис-пространстве, помогая формировать трехмерную структуру (рис.8а). Контакты внутри регионов, окруженных Dxz4 и Xist (ChrX: 75–100 Мб) и в меньшей степени, между Firre и Dxz4 (ChrX: 50–75 Мб) были увеличены, что свидетельствует о нарушении контактов исходящий из Dxz4 (Рис. 8a, Дополнительный Рис. 7a). Аналогичным образом, ядра Inv Firre ^Xi продемонстрировали сохранение двудольной структуры Xi, но также перераспределение контактов вокруг Firre , включая потерю проксимальных контактов (ChrX: 5–50 Mb) и усиление дистальных контактов (ChrX: 50–75 Мб), что подтверждено виртуальным 4 C (рис.8а, б; Дополнительный рис. 7а). Граница в локусе Firre на WT Xi или рядом с ним сохранялась после делеции или инверсии локуса (дополнительный рис. 7b). Хотя потеря Firre РНК в Δ Firre ^Xa не нарушила двудольную структуру Xi, произошли некоторые изменения в распределении контактов, предполагающие транс-эффекты (Рис. 8c, Дополнительный Рис. 7c). В частности, контакты увеличились в области, фланкированной Dxz4 и Xist (ChrX: 75–100 Mb), и уменьшились в очень дистальной теломерной области (ChrX: 165–170 Mb), что согласуется с увеличением доступности хроматина и экспрессия гена (рис.6c, 7c, 8c). Удаление Firre на Xa также привело к контактным изменениям на Xa, включая потерю границы в локусе или рядом с ним, что подтверждено анализом баллов изоляции (Рис. 8d; Дополнительный Рис. 7d, e).

Рис. 8: Изменения в структуре X 3D после удаления или инверсии Firre .

a коррелированно-преобразованные дифференциальные карты контактов Пирсона Xi с разрешением 500 кб подчеркивают различия между Δ Firre ^Xi и WT, а также между Inv Firre ^Xi и WT.Цветовая шкала показывает значения дифференциальной корреляции Пирсона, при этом потеря и усиление контактов у мутантов по сравнению с диким животным отображаются синим и красным цветом соответственно. См. Описание изменений в тексте. b Виртуальные графики 4 C, полученные из данных Hi-C с разрешением 500 кб, с использованием Firre в качестве точки обзора на Xi в WT (синий), Δ Firre ^Xi (зеленый) и Inv Firre ^Xi (серый) показывает увеличение контактов между Firre и Dxz4 в Inv Firre ^Xi . c коррелированно преобразованные дифференциальные контактные карты Пирсона Xa и Xi с разрешением 500 кб, чтобы выделить различия между Δ Firre ^Xa и WT. Цветовая шкала показывает значения дифференциальной корреляции Пирсона, при этом потеря и усиление контактов в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT отображаются синим и красным цветом соответственно. См. Описание изменений в тексте. d коррелированно преобразованные контактные карты Пирсона (разрешение 40 кб) Xa для 4 Мб вокруг локуса Firre подчеркивают потерю сильной границы между TAD на Xa в Δ Firre ^Xa по сравнению с WT (см. Дополнительный рис.7в для соответствующих отображений Xi).

Взятые вместе, наши результаты указывают на сотрудничество между Firre и Dxz4 в репрессии доступности хроматина на Xi, причем каждый локус вносит вклад в разделение двух супердоменов. Firre контакты с другими областями на Xi кажутся зависимыми от ориентации, напоминая зависимые от ориентации контакты, сделанные Dxz4 ²⁹ . Firre РНК оказывает транс-эффекты на структуру Xi 3D, потенциально вторичную по отношению к потере связывания h4K27me3 и CTCF.

Систематическая идентификация цис-регуляторных вариантов, вызывающих различия в экспрессии генов при скрещивании дрожжей

Рецензент № 2:

Статья Ренганаата и др. использует репортерный анализ и секвенирование Illumina для оценки влияния на экспрессию генов тысяч встречающихся в природе вариантов промоторов между двумя штаммами дрожжей. Они идентифицируют большое количество вариантов, которые оказывают значительное влияние на экспрессию, значительно расширяя каталог известных индивидуальных регуляторных вариантов.Они используют этот каталог для проверки давних представлений о молекулярной и эволюционной природе этих регуляторных вариантов. В целом, в экспериментах используется хороший дизайн с необходимыми контролями и репликацией для выявления вариантов с умеренным и большим влиянием на экспрессию генов. В целом я считаю, что эта работа вносит хороший вклад в эту область, и у меня есть только несколько комментариев и озабоченность по поводу используемых моделей и силы выводов, сделанных на основе этих моделей.

1) Во-первых, авторы имеют ряд потенциальных объясняющих переменных и тестируют каждую из них индивидуально на предмет связи с тем, влияет ли вариант значительно на экспрессию гена или нет.Результаты этого регрессионного анализа принимаются как есть, без попытки учесть корреляции между самими факторами. Авторы, кажется, знают об этой проблеме; один из самых больших индивидуальных коррелятов — это существенность гена, которая, как отмечают авторы, часто связана с некоторыми другими используемыми ковариатами. Из-за этой проблемы значимые ассоциации не могут быть интерпретированы как означающие, что конкретная ковариата важна, и причинно-следственные связи не могут быть установлены на основе такого анализа.Кроме того, авторы берут ряд значимых ковариат и интерпретируют их как согласующиеся с отрицательным отбором, но все ли эти ковариаты значимы после учета других, неизвестно. Различные ковариаты могут обнаруживать похожие сигналы, и в этом случае они не являются независимыми. Более полная схема моделирования позволила бы идентифицировать наиболее важные ковариаты и привести к лучшему пониманию того, какие сигналы действительно существуют в данных. Например, использование методов регуляризации (которые авторы действительно используют позже в другом анализе) для модели, включающей все ковариаты, поможет избежать независимых ковариат.

Мы согласны с рецензентом в том, что многие из наших характеристик коррелированы, и хотим подчеркнуть, что в анализе отдельных характеристик, на который ссылается рецензент, мы не намеревались идентифицировать отдельные особенности, которые вносят вклад в причинную связь вариантов, независимо от всех других характеристик. Напротив, на наш взгляд, когда несколько связанных характеристик связаны с причинно-следственной связью, это намекает на влияние лежащего в основе явления, которое не может быть полностью уловлено какой-либо одной особенностью. Чтобы придерживаться примера, выделенного автором обзора, ассоциации вариантной причинности с 1) более низкой производной частотой аллелей, 2) встречаемостью в промоторах несущественных генов и 3) встречаемостью в промоторах генов с меньшим количеством синтетических генетических взаимодействий, все согласуются с основным сигналом отрицательного отбора против вариантов, которые изменяют экспрессию основных генов.

Чтобы сделать этот момент очевидным для читателя, мы добавили следующее утверждение: «Хотя эти анализы не могут выделить отдельные вклады функций, которые коррелируют друг с другом, они предоставляют обзор характеристик причинных вариантов».

Следуя предложению рецензента попытаться учесть коррелированные признаки с помощью регуляризации, мы расширили наши существующие линейные эластичные сетевые модели (в которых мы смоделировали размер эффекта варианта как количественную переменную отклика) до логистических эластичных сетевых моделей того, является ли вариант вариантным или нет. причинно.Вкратце, мы поместили все функции в одну модель с 10-кратным повторением перекрестной проверки (5 повторов). Эта модель довольно плохо предсказывала вариантную причинно-следственную связь с областью ниже ROC 0,53 на 10% -ном тестовом наборе. В этой модели 1812 предикторов имели ненулевой показатель важности. Мы также подгоняем наши 112 моделей логистической регрессии для различных подмножеств признаков с эластичной чистой регуляризацией. Лучшая из этих моделей, которая включала не-TF-функции и индивидуальные TF-функции в конфигурации, не зависящей от цепочки, которые были значимыми в одномерном анализе, достигла AUC-ROC, равного 0.71, идентичный лучшей модели без регуляризации. Мы добавили эти результаты в статью (подраздел «Прогнозирование причинных вариантов»).

Из этих результатов мы делаем два вывода. Во-первых, регуляризация сама по себе не улучшает прогнозы. Мы подозреваем, что наш набор данных из нескольких сотен причинных вариантов, каждый в разном контексте промотора, недостаточно велик, чтобы делать более точные прогнозы. Во-вторых, что более конкретно вызывает озабоченность обозревателя, ассоциации признаков, которые мы обнаружили в наших одномерных логистических регрессиях, не сводятся к небольшому набору сильно коррелированных признаков.

2) Аналогичные аргументы могут быть сделаны для регрессионного анализа, который включает связывание факторов транскрипции; ШИМ TF не являются независимыми, и многие из них имеют сходство из-за схожих способов связывания. Кроме того, данные не демонстрируют четко «доказательства того, что причинные вариации часто нарушают связывание TF». Вместо этого данные показывают, что варианты, предсказанные для изменения связывания TF, коррелируют с тем, является ли вариант причинным. Опять же, прямую причинность из этого типа анализа сложно сделать.

Мы согласны с тем, что наше заключительное заявление для этого раздела («… предоставило четкие доказательства того, что причинные вариации часто нарушают связывание TF») было сформулировано слишком резко. Следуя предложению рецензента, мы завершаем этот раздел словами: «В целом, эти анализы предоставили четкие доказательства того, что варианты, которые, по прогнозам, нарушают связывание ТФ, с большей вероятностью изменят экспрессию гена, чем варианты, которые, по прогнозам, это не изменят».

Как мы указали в ответ на первый комментарий рецензента выше, нашим намерением в этом анализе не было приписывание независимого вклада в привязку отдельных факторов.Как отмечает рецензент, сделать это будет чрезвычайно сложно из-за того, что мотивы разделяют разные факторы. Чтобы прояснить этот момент для читателей, мы добавили утверждение: «Эти анализы не могут однозначно выявить совместное использование сходных мотивов связывания разными TF, но исследуют общую роль нарушенного связывания TF в причинной связи вариантов». Мы считаем, что вместе с нашим измененным заключительным предложением проясняет, как мы интерпретируем результаты по измененным TFBS.

Это еще более затрудняет отслеживание «слабого» связывания TF, поскольку, похоже, авторы приводят доводы в пользу модели, в которой отдельные варианты с одним нуклеотидом влияют на экспрессию, изменяя связывание нескольких TF, каждый из которых имеет низкую индивидуальную вероятность. быть связанным.Хотя хорошо известно, что многие слабые TFBS присутствуют в ДНК, я не знаком с изменениями в этих слабых TFBS, которые предлагаются в литературе в качестве основного пути, посредством которого экспрессия генов изменяется в природе. Две вещи могут помочь укрепить это утверждение. Во-первых, было бы полезно увидеть наглядный пример, который был найден в данных, например причинного варианта, который, как было предсказано, изменяет один сильный TFBS, и другого, который, как предполагалось, влияет на несколько слабых TFBS. Во-вторых, функциональная проверка некоторых из этих вариантов как влияющих на прогнозируемое связывание TF (а не какой-либо другой, неизвестный и непроверенный фактор) значительно усилит влияние этого раздела.Этот более поздний путь, вероятно, потребует значительных усилий, но, по крайней мере, необходимо признать, что такой функциональный анализ не был проведен, и модерировать утверждения в этом разделе.

Рецензент прав в том, что мы приводим доводы в пользу «модели, в которой отдельные варианты с одним нуклеотидом влияют на экспрессию, изменяя связывание нескольких TF, каждый из которых имеет низкую индивидуальную вероятность связывания», хотя мы и не утверждаем, что такие варианты всегда нужно изменять связывание нескольких TF .Обратите внимание, что в Обсуждении мы написали: «[варианты] могут нарушать один или несколько сайтов слабого связывания».

Это открытие сильной связи причинных вариантов с изменениями слабых TFBS подтверждается недавним исследованием de Boer et al., 2020, которое мы неоднократно цитируем в разделах «Результаты» и «Обсуждение». Авторы провели массовый параллельный репортерный анализ более 100 миллионов случайных фрагментов промотора, чтобы построить высокопрогнозную модель транскрипционной регуляции экспрессии РНК.В экспериментах in-silico, исследующих свою модель, авторы установили уровень отдельных TF равным нулю и проверили влияние этих «делеций» на экспрессию генов. Сильные регуляторные эффекты (то есть те, которые изменяли экспрессию более чем в 2 раза) отдельных факторов транскрипции были редкими и составляли только ~ 6% от средней экспрессии, вызванной типичным фрагментом промотора. Напротив, оставшиеся 94% экспрессии, вызванной типичным фрагментом промотора, были приписаны подавляющему большинству (99.9%) взаимодействий между ТФ и фрагментом, которые были индивидуально слабыми. Ключевой вывод de Boer et al. В статье говорится, что (курсив добавлен) «[…] случайная ДНК имеет различные уровни экспрессии (Рисунок 1), что можно объяснить связыванием TF (Рисунок 2), которые регулируют экспрессию в основном посредством слабых взаимодействий (Рисунок 6), которые, в свою очередь, , может быть легко нарушена [изменениями в последовательности ДНК] (рис. 5) ». Здесь мы расширяем это рассуждение де Бур и др. натуральным вариантам.

Чтобы помочь читателю понять эти моменты о слабых сайтах связывания, мы добавили новый рисунок 5 — приложение к рисунку 1, на котором показан пример варианта с явным изменением на сильную TFBS (панель A), а также вариант это не изменяет никаких узнаваемых сильных TFBS, но действительно меняет предсказанное связывание в нескольких слабых TFBS (панель B).

Мы признаем, что потребуется дополнительная работа (которая выходит за рамки данной рукописи) для более полного понимания роли слабых сайтов связывания в регуляторных вариациях. Мы изменили раздел «Обсуждение», чтобы прояснить этот момент.

Рецензент № 3:

Ренганаат и его коллеги описали высокопроизводительный анализ для проверки того, как естественные генетические варианты влияют на экспрессию генов, а также поиск закономерностей, которые позволяют нам предсказать такие эффекты.Основная новизна их подхода — в его одновариантном разрешении. Другие методы, такие как картирование eQTL и аллель-специфическая экспрессия (ASE), не имеют такого уровня разрешения, поэтому MPRA является ценным дополнением к набору инструментов генетики дрожжей. Возможность тестировать эпистатические взаимодействия соседних вариантов также является приятной особенностью.

1) Роль отдельных вариантов в развитии ASE является ключом к пониманию логики цис-регулирования. Авторы разработали олигонуклеотидов MPRA, ориентируясь на ранее идентифицированные гены ASE, и добавили случайно выбранные гены в качестве контроля.Было бы интересно увидеть агрегированные статистические данные о том, имеют ли гены ASE более вероятные причинные варианты, чем гены, не относящиеся к ASE; и если вышестоящие варианты отличаются от вариантов TSS в таких шаблонах.

Спасибо рецензенту за это предложение. Мы обратились к данным мРНК ASE, ранее собранным и интегрированным с локальными результатами eQTL в Albert et al., 2018. Эти данные содержат два независимых набора данных ASE для гибридных BY / RM. Здесь гены, которые продемонстрировали значимую для всего генома ASE по крайней мере в одном из этих двух наборов данных, с большей вероятностью имели причинный вариант MPRA (точный критерий Фишера: отношение шансов = 3.2, p <2.2e-16). Мы добавили этот результат в раздел «Результаты» и соответствующий параграф «Материалы и методы».

Это согласие между данными ASE и нашим анализом MPRA дополнительно подкрепляется корреляцией между количеством причинных вариантов MPRA и либо количеством наборов данных ASE со значимым результатом для данного гена (rho = 0,23, p <2,2e-16) или абсолютная величина ASE (rho = 0,14, p = 2e-8). Эти результаты были аналогичными для вариантов в библиотеках TSS и Upstream MPRA (таблица ответов автора 1).

Библиотека	Точный критерий Фишера (отношение шансов)	Точный критерий Фишера (p-значение)	Корреляция с числовой значимостью ASE наборов данных (rho)	Корреляция с числовой значимостью ASE наборов данных ( p-значение)	Корреляция с величиной ASE (rho)	Корреляция с величиной ASE (p-значение)
TSS	3.1	3e-7	0,18	2e-8	0,11	0,0009
Восходящий поток	2,8	6e-10	0,21	3e-12	0,13 4

В интересах краткости мы решили не включать эти более подробные анализы в статью. Обратите внимание, что данные ASE, которые мы использовали в приведенном выше анализе, немного отличаются от данных, которые мы использовали для разработки MPRA.Это просто потому, что с тех пор, как мы разработали MPRA, стало доступно больше данных ASE.

2) Прогнозирование причинно-следственных регуляторных вариантов — это святой Грааль функциональной геномики. В этом исследовании прогнозы показывают немного (но значительно) лучшие результаты, чем случайные. Стоит отметить, что существует больше не причинных вариантов, чем причинных, что приводит к несбалансированной проблеме классификации. Передискретизация меток меньшинства может стать хорошим началом для сбалансированного распределения данных и повышения производительности прогнозирования.

Мы признаем несбалансированность классов в обучающих наборах наших классификаторов и благодарим рецензента за это предложение. Чтобы проверить, улучшает ли передискретизация прогнозов, мы провели избыточную выборку причинных вариантов до равного представления причинных и непричинных вариантов в обучающем наборе, используемом для обучения наших классификаторов. Как и ожидалось, классификаторы с передискретизацией класса меньшинства были более стабильными во время обучения и лучше работали при прогнозировании на проверочных наборах : по 112 моделям медианная средняя Каппа Коэна увеличилась с 0.02 без передискретизации до 0,22 с передискретизацией (см. Верхнюю левую панель на изображении ответа автора 1; красная линия обозначает равенство). Наблюдалось незначительное улучшение AUC-ROC при прогнозировании на наборе , тест (лучшая модель улучшилась с 0,71 до 0,73; см. Верхнюю правую панель на изображении ответа автора 1; этот лучший классификатор использовал те же функции при обучении. этап, как в наших анализах в статье). Однако средняя производительность по 112 моделям осталась одинаковой (нижняя панель; красная линия соответствует одинаковой производительности; обратите внимание, что точки расположены симметрично относительно этой линии, что указывает на отсутствие общей тенденции к повышению производительности).Учитывая отсутствие систематических улучшений, мы решили не включать эти результаты в статью.

https://doi.org/10.7554/eLife.62669.sa2

Какая гистологическая находка характерна для рака мочевого пузыря in situ (CIS)?

• [Рекомендации] Национальная комплексная онкологическая сеть. Руководство NCCN по клинической практике в онкологии.Рак мочевого пузыря. NCCN.org. Доступно на http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf. Версия 6.2020 — 16 июля 2020 г .; Доступ: 23 февраля 2021 г.

• Эскудеро ДО, Широдкар СП, Локешвар В.Б. Канцерогенез мочевого пузыря и молекулярные пути. Локешвар В.Б. Опухоли мочевого пузыря: молекулярные аспекты и клиническое лечение . Нью-Йорк: Springer Science; 2010. 23-41.

• Spruck CH 3rd, Ohneseit PF, Gonzalez-Zulueta M, Esrig D, Miyao N, Tsai YC, et al.Два молекулярных пути к переходно-клеточной карциноме мочевого пузыря. Cancer Res . 1994 г. 1. 54 (3): 784-8. [Медлайн].

• Trias I, Algaba F, Condom E, Español I, Seguí J, Orsola I, et al. Мелкоклеточный рак мочевого пузыря. Представление 23 случаев и обзор 134 опубликованных случаев. Евро Урол . 2001, январь, 39 (1): 85-90. [Медлайн].

• Compérat EM, Burger M, Gontero P, Mostafid AH, Palou J, Rouprêt M, et al.Классификация уротелиальной карциномы и новая «Классификация опухолей мочевыделительной системы и мужских половых органов Всемирной организацией здравоохранения 2016». Евро Урол Фокус . 2019 май. 5 (3): 457-466. [Медлайн]. [Полный текст].

• Bessette PL, Abell MR, Herwig KR. Клинико-патологическое исследование плоскоклеточного рака мочевого пузыря. Дж Урол . 1974 июл.112 (1): 66-7. [Медлайн].

• Faysal MH. Плоскоклеточный рак мочевого пузыря. Дж Урол . 1981 ноябрь 126 (5): 598-9. [Медлайн].

• Лагвински Н., Томас А., Стивенсон А. Дж., Кэмпбелл С., Хошар А. П., Эль-Габри Е. и др. Плоскоклеточный рак мочевого пузыря: клинико-патологический анализ 45 случаев. Am J Surg Pathol . 2007 31 декабря (12): 1777-87. [Медлайн].

• Эль-Себайе М., Заглул М.С., Ховард Г., Мохтар А. Плоскоклеточная карцинома бильгарциального и небильгарциального мочевого пузыря: обзор этиологических особенностей, естественного течения болезни и ведения. Инт Дж. Клин Онкол . 2005 10 февраля (1): 20-5. [Медлайн].

• Heyns CF, van der Merwe A. Рак мочевого пузыря в Африке. Кан Дж Урол . 2008 15 февраля (1): 3899-908. [Медлайн].

• Томлинсон, округ Колумбия, Бальдо О, Харнден П., Ноулз Массачусетс. Экспрессия белка FGFR3 и ее связь с мутационным статусом и прогностическими переменными при раке мочевого пузыря. Дж. Патол . 2007 Сентябрь 213 (1): 91-8. [Медлайн]. [Полный текст].

• Эсваракумар В.П., Лакс И., Шлессингер Дж.Передача клеточных сигналов рецепторами фактора роста фибробластов. Фактор роста цитокинов Ред. . 2005 г., 16 (2): 139-49. [Медлайн].

• Fadl-Elmula I. Хромосомные изменения уроэпителиальных карцином. Клеточная хромосома . 2005 7 августа 4: 1. [Медлайн]. [Полный текст].

• Ноулз MA. Молекулярные подтипы рака мочевого пузыря: Джекил и Хайд или мел и сыр ?. Канцерогенез . 2006 марта, 27 (3): 361-73. [Медлайн].

• Салинас-Санчес А.С., Лоренцо-Ромеро Дж. Г., Хименес-Бахс Дж. М., Санчес-Санчес Ф., Донате-Морено М. Дж., Рубио-Дель-Кампо А. и др.Влияние мутаций гена p53 на выживаемость пациентов с переходно-клеточной карциномой мочевого пузыря: долгосрочное исследование. Урол Онкол . 2008 ноябрь-декабрь. 26 (6): 620-6. [Медлайн].

• Миямото Х., Шуин Т., Икеда И., Хосака М., Кубота Ю. Потеря гетерозиготности по локусам гена супрессора опухоли p53, RB, DCC и APC при раке мочевого пузыря человека. Дж Урол . 1996 апр. 155 (4): 1444-7. [Медлайн].

• Карам Дж. А., Лотан Ю., Каракевич П. И., Ашфак Р., Сагаловский А. И., Рёрборн К. Г. и др.Использование комбинированных биомаркеров апоптоза для прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря и смертности после радикальной цистэктомии. Ланцет Онкол . 2007 февраля 8 (2): 128-36. [Медлайн].

• Кэмпбелл С.К., Вольперт О.В., Иванович М., Бук Н.П. Молекулярные медиаторы ангиогенеза при раке мочевого пузыря. Cancer Res . 1998 15 марта. 58 (6): 1298-304. [Медлайн].

• Чан К.С., Эспиноза I, Чао М., Вонг Д., Аиллес Л., Дин М. и др. Идентификация, молекулярная характеристика, клинический прогноз и терапевтическое воздействие на клетки, инициирующие опухоль мочевого пузыря человека. Proc Natl Acad Sci U S A . 2009 18 августа. 106 (33): 14016-21. [Медлайн]. [Полный текст].

• Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Lozano J, Saint F, Cordon-Cardo C. Определение молекулярных профилей неблагоприятных исходов у пациентов с инвазивным раком мочевого пузыря с использованием олигонуклеотидных микрочипов. Дж. Клин Онкол . 2006 10 февраля. 24 (5): 778-89. [Медлайн].

• Brennan P, Bogillot O, Cordier S, Greiser E, Schill W., Vineis P, et al. Курение сигарет и рак мочевого пузыря у мужчин: объединенный анализ 11 исследований случай-контроль. Инт Дж. Рак . 2000 15 апреля. 86 (2): 289-94. [Медлайн].

• Фортуни Дж., Кожевинас М., Чанг-Клод Дж., Гонсалес Калифорния, Час М, Йокель К. Х. и др. Табак, род занятий и непереходно-клеточная карцинома мочевого пузыря: международное исследование методом случай-контроль. Инт Дж. Рак . 1999, 5 января. 80 (1): 44-6. [Медлайн].

• Freedman ND, Silverman DT, Hollenbeck AR, Schatzkin A, Abnet CC. Связь между курением и риском рака мочевого пузыря среди мужчин и женщин. ЯМА . 2011 17 августа. 306 (7): 737-45. [Медлайн]. [Полный текст].

• Камбербэтч MG, Cox A, Teare D, Catto JW. Современное профессиональное воздействие канцерогенов и рак мочевого пузыря: систематический обзор и метаанализ. JAMA Oncol . 2015 декабрь 1 (9): 1282-90. [Медлайн].

• Baris D, Waddell R, Beane Freeman LE, Schwenn M, Colt JS и др. Повышенный рак мочевого пузыря в Северной Новой Англии: роль питьевой воды и мышьяка. Национальный институт рака . 2016 Сентябрь 108 (9): [Medline].

• Нельсон Р. Вода из колодца, загрязненная мышьяком, увеличивает риск рака мочевого пузыря. Медицинские новости Medscape. Доступно на http://www.medscape.com/viewarticle/862914. 5 мая 2016 г .; Дата обращения: 7 мая 2016 г.

• Штейн Дж. П., Скиннер Э. К., Бойд С. Д., Скиннер Д. Г.. Плоскоклеточный рак мочевого пузыря, связанный с терапией циклофосфамидом гранулематоза Вегенера: сообщение о 2 случаях. Дж Урол .1993 г., 149 (3): 588-9. [Медлайн].

• Фигероа Дж. Д., Кутрос С., Кольт Дж. С., Кожевинас М., Гарсия-Клосас М. и др. Модификация профессионального воздействия на риск рака мочевого пузыря с помощью общих генетических полиморфизмов. Национальный институт рака . 2015 Ноябрь 107 (11): [Medline].

• Эль-Болкаини М.Н., Мохтар Н.М., Гонейм М.А., Хусейн М.Х. Влияние шистосомоза на патологию карциномы мочевого пузыря. Рак . 1981, 15 декабря. 48 (12): 2643-8.[Медлайн].

• Botelho M, Ferreira AC, Oliveira MJ, Domingues A, Machado JC, da Costa JM. Общий антиген Schistosoma haematobium вызывает повышенную пролиферацию, миграцию и инвазию и снижает апоптоз нормальных эпителиальных клеток. Инт Дж. Паразитол . 2009 Август 39 (10): 1083-91. [Медлайн].

• Ахмад I, Барнетсон Р.Дж., Кришна Н.С. Ороговевающая плоскоклеточная метаплазия мочевого пузыря: обзор. Урол Инт . 2008. 81 (3): 247-51.[Медлайн].

• Хан М.С., Торнхилл Дж. А., Гаффни Э, Лофтус Б., Батлер МР. Кератинизирующая плоскоклеточная метаплазия мочевого пузыря: естественное течение и рационализация лечения на основе обзора 54-летнего опыта. Евро Урол . 2002 ноябрь 42 (5): 469-74. [Медлайн].

• Ньюман Д.М., Браун-младший, Джей А.К., Понтиус Э. Плоскоклеточный рак мочевого пузыря. Дж Урол . 1968 Октябрь 100 (4): 470-3. [Медлайн].

• Faysal MH, Freiha FS.Первичное новообразование в дивертикулах мочевого пузыря. Отчет о 12 случаях. Бр Дж Урол . 1981, апрель, 53 (2): 141-3. [Медлайн].

• Юрдакуль Т, Авундук МЦ, Пискин ММ. Чистый плоскоклеточный рак после внутрипузырного лечения БЦЖ. Отчет о болезни. Урол Инт . 2005. 74 (3): 283-5. [Медлайн].

• СТЮАРТ WT. Карцинома мочевого пузыря, связанная с экстрофией. Отчет о случае и обзор литературы. Va Med Mon (1918) .1962, январь 89: 39-42. [Медлайн].

• Рибейро Дж. С., Сильва С., Соуза Л., Гарсия П., Сантос А. [Плоскоклеточный рак при экстрофии мочевого пузыря]. Actas Urol Esp . 2005 29 января (1): 110-2. [Медлайн].

• Gupta S, Gupta IM. Ectopia vesicae, осложненная плоскоклеточным раком. Бр Дж Урол . 1976 Август 48 (4): 244. [Медлайн].

• Rieder JM, Parsons JK, Gearhart JP, Schoenberg M. Первичная плоскоклеточная карцинома в нереконструированном экстрофическом мочевом пузыре. Урология . 2006 Январь 67 (1): 199. [Медлайн].

• Sheldon CA, Clayman RV, Gonzalez R, Williams RD, Fraley EE. Злокачественные урахальные поражения. Дж Урол . 1984, январь, 131 (1): 1-8. [Медлайн].

• Lin RY, Rappoport AE, Deppisch LM, Natividad NS, Katz W. Плоскоклеточный рак мочеиспускательного канала. Дж Урол . 1977 декабрь 118 (6): 1066-7. [Медлайн].

• SHAW RE. Плоскоклеточный рак кисты мочеиспускательного канала. Бр Дж Урол . 1958 30 марта (1): 87-9. [Медлайн].

• Чоу YC, Лин WC, Tzen CY, Chow YK, Lo KY. Плоскоклеточный рак мочеиспускательного канала. Дж Урол . 2000 Март 163 (3): 903-4. [Медлайн].

• Fujiyama C, Nakashima N, Tokuda Y, Uozumi J. Плоскоклеточный рак урахуса. Int J Urol . 2007 октября, 14 (10): 966-8. [Медлайн].

• Рак в цифрах и фактах 2021. Американское онкологическое общество.Доступно по адресу https://www.cancer.org/content/dam/cancer-org/research/cancer-facts-and-statistics/annual-cancer-facts-and-figures/2021/cancer-facts-and-figures- 2021.pdf. Доступ: 23 февраля 2021 г.

• Статистика рака: рак мочевого пузыря. Национальный институт рака. Доступно по адресу https://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html. Доступ: 23 февраля 2021 г.

• Сигель Р.Л., Миллер К.Д., Джемаль А. Статистика рака, 2019. CA Cancer J Clin .2019 января 69 (1): 7-34. [Медлайн]. [Полный текст].

• Доусон С., Уитфилд Х. Азбука урологии. Урологические злокачественные новообразования — II: уротелиальные опухоли. BMJ . 1996 27 апреля, 312 (7038): 1090-4. [Медлайн]. [Полный текст].

• Abrahams NA, Moran C, Reyes AO, Siefker-Radtke A, Ayala AG. Мелкоклеточный рак мочевого пузыря: современное клинико-патологическое исследование 51 случая. Гистопатология . 2005, январь, 46 (1): 57-63. [Медлайн].

• Лориш К., Мюррей Н., Пиклз Т., Салливан Л.Мелкоклеточная карцинома мочевого пузыря: отдаленный результат с интегрированной химиолучевой терапией. Рак . 1999, 1 декабря. 86 (11): 2346-52. [Медлайн].

• Гауда I, Мохтар Н, Билал Д, Эль-Болкайны Т., Эль-Болкайны НМ. Бильгарциоз и рак мочевого пузыря: анализ временных тенденций 9843 пациентов. J Egypt Natl Canc Inst . 2007 июня 19 (2): 158-62. [Медлайн].

• Феликс А.С., Солиман А.С., Халед Х., Заглул М.С., Банерджи М., Эль-Баради М. и др.Изменения в структуре рака мочевого пузыря в Египте за последние 26 лет. Контроль причин рака . 2008 май. 19 (4): 421-9. [Медлайн].

• Elsobky E, El-Baz M, Gomha M, Abol-Enein H, Shaaban AA. Прогностическое значение ангиогенеза при плоскоклеточном раке мочевого пузыря, ассоциированном с шистосомой. Урология . 2002 Июль 60 (1): 69-73. [Медлайн].

• Griffiths TR, Charlton M, Neal DE, Powell PH. Лечение рака in situ внутрипузырной палочкой Кальметта-Герена без обслуживания. Дж Урол . 2002 июн. 167 (6): 2408-12. [Медлайн].

• Pycha A, Mian C, Posch B, Haitel A, Mokhtar AA, El-Baz M и др. Численные хромосомные аберрации при мышечно-инвазивном плоскоклеточном раке и переходно-клеточном раке мочевого пузыря: альтернатива классическим прогностическим показателям ?. Урология . 1999 Май. 53 (5): 1005-10. [Медлайн].

• Shaaban AA, Javadpour N, Tribukait B, Ghoneim MA. Прогностическое значение анализа проточной ДНК и изоантигенов клеточной поверхности при карциноме бильгарциального пузыря. Урология . 1992 марта 39 (3): 207-10. [Медлайн].

• Ghoneim MA, Ashamallah AK, Awaad HK, Whitmore WF Jr. Рандомизированное испытание цистэктомии с предоперационной лучевой терапией или без нее для карциномы бильгарциального пузыря. Дж Урол . 1985 августа 134 (2): 266-8. [Медлайн].

• Cheng L, Pan CX, Yang XJ, Lopez-Beltran A, MacLennan GT, Lin H, et al. Мелкоклеточный рак мочевого пузыря: клинико-патологический анализ 64 пациентов. Рак . 2004, 1 сентября. 101 (5): 957-62. [Медлайн].

• Шахаб Н. Внелегочный мелкоклеточный рак мочевого пузыря. Семин Онкол . 2007 февраля. 34 (1): 15-21. [Медлайн].

• Mackey JR, Au HJ, Hugh J, Venner P. Мелкоклеточная карцинома мочеполовой системы: определение клинических и терапевтических факторов, связанных с выживаемостью. Дж Урол . 1998 Май. 159 (5): 1624-9. [Медлайн].

• Choong NW, Quevedo JF, Kaur JS.Мелкоклеточный рак мочевого пузыря. Опыт клиники Мэйо. Рак . 2005 15 марта. 103 (6): 1172-8. [Медлайн].

• van Rhijn BW, Burger M, Lotan Y, Solsona E, Stief CG, Sylvester RJ, et al. Рецидив и прогрессирование заболевания при немышечно-инвазивном раке мочевого пузыря: от эпидемиологии к стратегии лечения. Евро Урол . 2009 Сентябрь 56 (3): 430-42. [Медлайн].

• Фернандес-Гомес Дж., Сольсона Э., Унда М., Мартинес-Пиньейро Л., Гонсалес М., Эрнандес Р. и др.Факторы прогноза у пациентов с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря, получавших лечение бациллой Кальметта-Герена: многомерный анализ данных четырех рандомизированных исследований CUETO. Евро Урол . 2008 май. 53 (5): 992-1001. [Медлайн].

• Лотан Й, Инман Б.А., Портен С. Новообразования мочевого пузыря: немышечный инвазивный рак мочевого пузыря. AUA. Доступно по адресу https://university.auanet.org/modules/webapps/core/index.cfm#/corecontent/76. 5 февраля 2020 г .; Дата обращения: 13 сентября 2020 г.

• [Рекомендации] Барокас Д., Бурджиан С., Альварес Р., Даунс TM.Микрогематурия: Руководство AUA / SUFU. AUA. Доступно по адресу https://www.auanet.org/guidelines/microhemuria. 2020; Дата обращения: 13 сентября 2020 г.

• Ча Е.К., Тирсар Л.А., Швентнер С., Христос П.Дж., Миан С., Хенненлоттер Дж. И др. Иммуноцитология — надежный предиктор наличия рака мочевого пузыря у пациентов с безболезненной гематурией: многоцентровое исследование. Евро Урол . 2012 января 61 (1): 185-92. [Медлайн].

• Strittmatter F, Buchner A, Karl A, Sommer ML, Straub J, Tilki D и др.Индивидуальная кривая обучения снижает клиническую ценность цитологического исследования мочи. Clin Genitourin Cancer . 2011 Сентябрь 9 (1): 22-6. [Медлайн].

• Lotan Y, Roehrborn CG. Экономическая эффективность модифицированного протокола лечения, заменяющего опухолевые маркеры мочевого пузыря на цистоскопию для последующего наблюдения за пациентами с переходно-клеточной карциномой мочевого пузыря: аналитический подход к решению. Дж Урол . 2002 Январь 167 (1): 75-9. [Медлайн].

• [Рекомендации] Бабжук М., Бургер М., Комперат Э.М., Гонтеро П., Мостафид А.Х., Палоу Дж. И др.Рекомендации Европейской ассоциации урологов по немышечно-инвазивному раку мочевого пузыря (TaT1 и карцинома in situ) — обновление 2019 г. Евро Урол . 2019 Ноябрь 76 (5): 639-657. [Медлайн]. [Полный текст].

• Apolo AB, Vogelzang NJ, Theodorescu D. Новые и многообещающие стратегии лечения рака мочевого пузыря. Am Soc Clin Oncol Обучающая книга . 2015. 35: 105-12. [Медлайн]. [Полный текст].

• Мерфи WM, Crabtree WN, Jukkola AF, Soloway MS.Диагностическая ценность мочи по сравнению с промыванием мочевого пузыря у пациентов с раком мочевого пузыря. Дж Урол . 1981 Сентябрь 126 (3): 320-2. [Медлайн].

• Локешвар В.Б., Солоуэй МС. Текущие тесты на опухоль мочевого пузыря: удовлетворяет ли их предполагаемая полезность клинической необходимости? Дж Урол . 2001 апр. 165 (4): 1067-77. [Медлайн].

• Гроссман Х. Б., Солоуэй М., Мессинг Э., Кац Г., Штейн Б., Кассабиан В. и др. Эпиднадзор за рецидивирующим раком мочевого пузыря с использованием протеомного анализа в месте оказания медицинской помощи. ЯМА . 2006 18 января. 295 (3): 299-305. [Медлайн].

• Аль-Сухун С., Хусейн М. Молекулярная биология переходно-клеточного рака. Crit Rev Oncol Hematol . 2003 Август 47 (2): 181-93. [Медлайн].

• Halling KC, Кипп BR. Обнаружение рака мочевого пузыря с помощью FISH (анализ UroVysion). Адв. Анат Патол . 2008 15 сентября (5): 279-86. [Медлайн].

• Soloway MS, Briggman V, Carpinito GA, Chodak GW, Church PA, Lamm DL, et al.Использование нового онкомаркера, NMP22 в моче, для выявления скрытой или быстро рецидивирующей переходно-клеточной карциномы мочевыводящих путей после хирургического лечения. Дж Урол . 1996, август, 156 (2, часть 1): 363-7. [Медлайн].

• van Rhijn BW, van der Poel HG, van der Kwast TH. Маркеры мочи для наблюдения за раком мочевого пузыря: систематический обзор. Евро Урол . 2005 июн. 47 (6): 736-48. [Медлайн].

• Hall MC, Chang SS, Dalbagni G, Pruthi RS, Seigne JD, Skinner EC и др.Руководство по лечению немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (стадии Ta, T1 и Tis): обновление 2007 г. Дж Урол . 2007 декабрь 178 (6): 2314-30. [Медлайн].

• Американский объединенный комитет по раку. Мочевой пузырь. Amin MB, Edge S, Greene F, Byrd DR, Brookland RK и др., Под ред. AJCC Руководство по стадированию рака . 8-е изд. Нью-Йорк: Спрингер; 2017.

• Сватек Р.С., Данешманд С., Сингх П. Новообразования мочевого пузыря: мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря.AUA. Доступно по адресу https://university.auanet.org/modules/webapps/core/index.cfm#/corecontent/177. 10 января 2020 г .; Дата обращения: 13 сентября 2020 г.

• Chedgy EC, Черный ПК. Радикальная цистэктомия и мультидисциплинарное лечение мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря. JAMA Oncol . 2016 5 мая. [Medline]. [Полный текст].

• Митин Т. Переосмысление радикальной цистэктомии как лучшего выбора для большинства пациентов с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря. JAMA Oncol . 2016 5 мая. [Medline]. [Полный текст].

• Teo MT, Dyrskjøt L, Nsengimana J, Buchwald C, Snowden H, Morgan J, et al. Секвенирование следующего поколения определяет варианты MRE11A зародышевой линии как маркеры результатов лучевой терапии при мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря. Энн Онкол . 2014 Апрель 25 (4): 877-83. [Медлайн]. [Полный текст].

• Serretta V, Galuffo A, Pavone C, Allegro R, Pavone-MacAluso M. Гемцитабин в внутрипузырном лечении переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря Ta-T1: исследование I-II фазы маркерных поражений. Урология . 2005 Январь 65 (1): 65-9. [Медлайн].

• Sylvester RJ, van der Meijden AP, Witjes JA, Kurth K. Bacillus calmette-guerin в сравнении с химиотерапией для внутрипузырного лечения пациентов с карциномой мочевого пузыря in situ: метаанализ опубликованных результатов рандомизированных клинических испытаний. Дж Урол . 2005 июль 174 (1): 86-91; обсуждение 91-2. [Медлайн].

• Witjes JA, Hendricksen K. Внутрипузырная фармакотерапия неинвазивного рака мочевого пузыря: критический анализ имеющихся в настоящее время лекарств, графиков лечения и долгосрочных результатов. Евро Урол . 2008, январь, 53 (1): 45-52. [Медлайн].

• Захарофф Д.А., Хоффман Б.С., Хупер Н.Б., Бенджамин С.Дж. младший, Хурана К.К., Ханс К.В. и др. Внутрипузырная иммунотерапия поверхностного рака мочевого пузыря хитозаном / интерлейкином-12. Cancer Res . 2009 авг. 1. 69 (15): 6192-9. [Медлайн]. [Полный текст].

• Islam MA, Bhuiyan ZH, Shameem IA. Внутрипузырная адъювантная терапия с использованием митомицина C. Mymensingh Med J . 2006 15 января (1): 40-4.[Медлайн].

• Herr HW, Dalbagni G, Donat SM. Bacillus Calmette-Guérin без поддерживающей терапии для неинвазивного рака мочевого пузыря с высоким риском. Евро Урол . 2011 Июль 60 (1): 32-6. [Медлайн].

• Schmidbauer J, Witjes F, Schmeller N, Donat R, Susani M, Marberger M. Улучшенное обнаружение уротелиальной карциномы in situ с помощью флуоресцентной цистоскопии гексаминолевулинатом. Дж Урол . 2004, январь 171 (1): 135-8. [Медлайн].

• Jichlinski P, Guillou L, Karlsen SJ, Malmström PU, Jocham D, Brennhovd B, et al. Флуоресцентная цистоскопия гексиламинолевулинатом: новый диагностический инструмент для фотодиагностики поверхностного рака мочевого пузыря — многоцентровое исследование. Дж Урол . 2003 июл.170 (1): 226-9. [Медлайн].

• Hungerhuber E, Stepp H, Kriegmair M, Stief C, Hofstetter A, Hartmann A, et al. Семилетний опыт применения 5-аминолевулиновой кислоты в обнаружении переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря. Урология . 2007 Февраль 69 (2): 260-4. [Медлайн].

• Kausch I, Sommerauer M, Montorsi F, Stenzl A, Jacqmin D, Jichlinski P, et al. Фотодинамическая диагностика при немышечно-инвазивном раке мочевого пузыря: систематический обзор и совокупный анализ проспективных исследований. Евро Урол . 2010 апр. 57 (4): 595-606. [Медлайн].

• Waknine Y. FDA одобряет Cysview для цистоскопического обнаружения папиллярного рака мочевого пузыря. Medscape Medical News, 4 июня 2010 г.Доступно на http://www.medscape.com/viewarticle/722923. Доступ: 10 января 2013 г.

• Стенд CM, Tannock IF. Преимущества адъювантной химиотерапии при раке мочевого пузыря. JAMA Oncol . 2015 Сентябрь 1 (6): 727-8. [Медлайн].

• Стандартная или расширенная тазовая лимфаденэктомия при лечении пациентов, перенесших операцию по поводу инвазивного рака мочевого пузыря. ClinicalTrials.gov. ClinicalTrials.gov. Доступно на http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01224665.Доступ: 17 августа 2018 г.

• Mukesh M, Cook N, Hollingdale AE, Ainsworth NL, Russell SG. Мелкоклеточная карцинома мочевого пузыря: 15-летний ретроспективный обзор лечения и выживаемости в Anglian Cancer Network. БЖУ Инт . 2009 Март 103 (6): 747-52. [Медлайн].

• Brinkman MT, Karagas MR, Zens MS, Schned A, Reulen RC, Zeegers MP. Минералы и витамины и риск рака мочевого пузыря: результаты исследования в Нью-Гэмпшире. Контроль причин рака . 2010 г., 21 (4): 609-19. [Медлайн]. [Полный текст].

• O’Donnell MA, Lilli K, Leopold C. Промежуточные результаты национального многоцентрового исследования фазы II комбинированной палочки Кальметта-Герена плюс интерферон альфа-2b для лечения поверхностного рака мочевого пузыря. Дж Урол . 2004 Сентябрь 172 (3): 888-93. [Медлайн].

• Nepple KG, Lightfoot AJ, Rosevear HM, O’Donnell MA, Lamm DL. Bacillus Calmette-Guérin с интерфероном a-2b или без него и мегадозой по сравнению с рекомендуемой суточной дозой витаминов во время индукции и поддерживающего внутрипузырного лечения немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря. Дж Урол . 2010 ноябрь 184 (5): 1915-9. [Медлайн].

• Камат А.М., Дикштейн Р.Дж., Мессетти Ф., Андерсон Р., Претч С.М., Гонсалес Г.Н. и др. Использование флуоресцентной гибридизации in situ для прогнозирования ответа на терапию бациллами Кальметта-Герена при раке мочевого пузыря: результаты проспективного исследования. Дж Урол . 2012 Март 187 (3): 862-7. [Медлайн]. [Полный текст].

• Mulcahy N. FDA одобряет пембролизумаб для лечения рака мочевого пузыря с высоким риском. Медицинские новости Medscape.Доступно на https://www.medscape.com/viewarticle/

  8. 8 января 2020 г .; Доступ: 9 января 2020 г.

• Балар А.В., Кулкарни Г.С., Учио Е.М., Бурманс Дж., Мурей Л., Кригер ЛЕМ и др. Основной доклад 057: Фаза II исследования пембролизумаба (пембро) для пациентов (пациентов) с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (NMIBC) высокого риска, не реагирующих на бациллу кальметта-герена (БЦЖ). Журнал клинической онкологии 37, вып. 7_suppl (01 марта 2019 г.) 350-350. [Полный текст].

• Барлоу Л., Маккирнан Дж. М., Бенсон М.С.Долгосрочные результаты выживаемости с внутрипузырным введением доцетаксела при рецидивирующем немышечно-инвазивном раке мочевого пузыря после предшествующей терапии бациллами Кальметта-Герена. Дж Урол . 2013 Март 189 (3): 834-9. [Медлайн].

• Schmidbauer J, Witjes F, Schmeller N, Donat R, Susani M, Marberger M. Улучшенное обнаружение уротелиальной карциномы in situ с помощью флуоресцентной цистоскопии гексаминолевулинатом. Дж Урол . 2004, январь 171 (1): 135-8. [Медлайн].

• Jichlinski P, Guillou L, Karlsen SJ, Malmström PU, Jocham D, Brennhovd B, et al.Флуоресцентная цистоскопия гексиламинолевулинатом: новый диагностический инструмент для фотодиагностики поверхностного рака мочевого пузыря — многоцентровое исследование. Дж Урол . 2003 июл.170 (1): 226-9. [Медлайн].

• Hungerhuber E, Stepp H, Kriegmair M, Stief C, Hofstetter A, Hartmann A, et al. Семилетний опыт применения 5-аминолевулиновой кислоты в обнаружении переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря. Урология . 2007 Февраль 69 (2): 260-4. [Медлайн].

• Fradet Y, Grossman HB, Gomella L, Lerner S, Cookson M, Albala D, et al.Сравнение флуоресцентной цистоскопии гексаминолевулинатом и цистоскопии в белом свете для обнаружения карциномы in situ у пациентов с раком мочевого пузыря: многоцентровое исследование III фазы. Дж Урол . 2007 июл. 178 (1): 68-73; обсуждение 73. [Medline].

• Джохам Д., Витджес Ф, Вагнер С., Зейлемейкер Б., ван Мурселар Дж., Гримм МО и др. Улучшение выявления и лечения рака мочевого пузыря с помощью визуализации гексаминолевулинатом: проспективное многоцентровое исследование фазы III. Дж Урол . 2005 сентябрь 174 (3): 862-6; обсуждение 866. [Medline].

• Stenzl A, Burger M, Fradet Y, Mynderse LA, Soloway MS, Witjes JA, et al. Флюоресцентная цистоскопия под гексаминолевулинатом снижает вероятность рецидивов у пациентов с немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря. Дж Урол . 2010 ноябрь 184 (5): 1907-13. [Медлайн].

• Герман Г.Г., Могенсен К., Карлссон С., Маркуссен Н., Дуун С. Трансуретральная резекция опухолей мочевого пузыря под контролем флуоресценции снижает количество рецидивов опухоли мочевого пузыря из-за меньшего количества остаточной опухолевой ткани у пациентов Ta / T1: рандомизированное двухцентровое исследование. БЖУ Инт . 2011 Октябрь 108 (8, часть 2): E297-303. [Медлайн].

• Тилки Д., Райх О., Сватек Р.С., Каракевич П.И., Кассуф В., Новара Г. и др. Характеристики и исходы пациентов с клинической карциномой in situ, получавших только радикальную цистэктомию: международное исследование с участием 243 пациентов. Дж Урол . 2010 май. 183 (5): 1757-63. [Медлайн].

• Djaladat H, Bruins HM, Miranda G, Cai J, Skinner EC, Daneshmand S. Поражение репродуктивных органов у пациенток, перенесших радикальную цистэктомию по поводу уротелиального рака мочевого пузыря. Дж Урол . Dec 2012. 188: 2134-2138.

• Liedberg, F., Jancke, G., Sörenby, A., et al. Следует ли нам воздерживаться от выполнения овариэктомии в сочетании с радикальной цистэктомией при раке мочевого пузыря? Евро Урол . 2017. 71: 851-853.

• Ник, Н.Н., Ванг, Р., Ши, И.М. и др. Происхождение и патогенез серозной карциномы таза (яичников, маточных труб и первичной брюшины). Анну Рев Патол . 2014. 9: 27-45.

• Davis JW, Castle EP, Pruthi RS, Ornstein DK, Guru KA.Роботизированная радикальная цистэктомия: обзор экспертной группы текущего состояния и будущего направления. Урол Онкол . 2010 сен-окт. 28 (5): 480-6. [Медлайн].

• Чанг СС, Куксон МС. Радикальная цистэктомия при раке мочевого пузыря: аргументы в пользу раннего вмешательства. Урол Клин Норт Ам . 2005 г., май. 32 (2): 147-55. [Медлайн].

• Санчес-Ортис РФ, Хуанг В.С., Мик Р., Ван Арсдален К.Н., Вейн А.Дж., Малкович С.Б. Интервал более 12 недель между диагнозом инвазии в мышцы и цистэктомией связан с худшим исходом при раке мочевого пузыря. Дж Урол . 2003, январь, 169 (1): 110-5; Обсуждение 115. [Medline].

• Jürgen E Gschwend 1, Matthias M Heck 2, Jan Lehmann 3, Herbert Rübben 4, Peter Albers 5, Johannes M Wolff 6 и др. Расширенная и ограниченная диссекция лимфатических узлов у пациентов с раком мочевого пузыря, перенесших радикальную цистэктомию: результаты выживаемости в проспективном рандомизированном исследовании. Европейская урология . Апрель 2019. 75: 604-611. [Медлайн].

• Рагхаван Д., Берджесс Е., Гастон К.Э., Хаке М.Р., Риггс С.Б.Неоадъювантная и адъювантная химиотерапия при инвазивном раке мочевого пузыря. Семин Онкол . 2012 Октябрь 39 (5): 588-97. [Медлайн].

• Winquist E, Kirchner TS, Segal R, Chin J, Lukka H. Неоадъювантная химиотерапия переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря: систематический обзор и метаанализ. Дж Урол . 2004 февраль 171 (2, часть 1): 561-9. [Медлайн].

• Гроссман Н.Б., Натале Р.Б., Танген С.М., Спейтс В.О., Фогельзанг, штат Нью-Джерси, Трамп Д.Л. и др.Неоадъювантная химиотерапия плюс цистэктомия по сравнению с одной цистэктомией при местнораспространенном раке мочевого пузыря. N Engl J Med . 2003 28 августа. 349 (9): 859-66. [Медлайн].

• Herr HW, Faulkner JR, Grossman HB, Natale RB, deVere White R, Sarosdy MF, et al. Хирургические факторы влияют на исходы рака мочевого пузыря: отчет совместной группы. Дж. Клин Онкол . 2004 15 июля. 22 (14): 2781-9. [Медлайн].

• фон дер Маасе h2, Хансен С.В., Робертс Дж. Т., Доглиотти Л., Оливер Т., Мур М. Дж. И др.Гемцитабин и цисплатин в сравнении с метотрексатом, винбластином, доксорубицином и цисплатином при запущенном или метастатическом раке мочевого пузыря: результаты большого рандомизированного многонационального многоцентрового исследования фазы III. Дж. Клин Онкол . 2000 сен; 18. 17: 3068-77.

• Griffiths G, Hall R, Sylvester R, Raghavan D, Parmar MK. Международное исследование фазы III по оценке неоадъювантной химиотерапии цисплатином, метотрексатом и винбластином при мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря: долгосрочные результаты исследования BA06 30894. Дж. Клин Онкол . 2011 г., 1 июня. 29 (16): 2171-7. [Медлайн]. [Полный текст].

• Mooso BA, Vinall RL, Mudryj M, Yap SA, deVere White RW, Ghosh PM. Роль ингибиторов семейства EGFR в мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря: обзор клинических данных и молекулярных доказательств. Дж Урол . 2015 Январь 193 (1): 19-29. [Медлайн].

• Sternberg CN, Skoneczna I, Kerst JM, Albers P, Fossa SD, et al. Сравнение немедленной и отсроченной химиотерапии после радикальной цистэктомии у пациентов с уротелиальной карциномой мочевого пузыря pT3-pT4 или N + M0 (EORTC 30994): межгрупповое открытое рандомизированное исследование фазы 3. Ланцет Онкол . 2015 16 января (1): 76-86. [Медлайн].

• Саксман С.Б., Проперт К.Дж., Эйнхорн Л.Х., Кроуфорд Э.Д., Таннок I, Рагхаван Д. и др. Долгосрочное наблюдение за межгрупповым исследованием фазы III цисплатина отдельно или в комбинации с метотрексатом, винбластином и доксорубицином у пациентов с метастатической уротелиальной карциномой: совместное групповое исследование. Дж. Клин Онкол . 1997 15 июля (7): 2564-9. [Медлайн].

• Sternberg CN, de Mulder P, Schornagel JH, Theodore C, Fossa SD, van Oosterom AT, et al.Семилетнее обновление исследования III фазы EORTC, посвященного высокодозной химиотерапии M-VAC и G-CSF по сравнению с классическим M-VAC при распространенных опухолях уротелиального тракта. Eur J Cancer . 2006 Январь 42 (1): 50-4. [Медлайн].

• фон дер Маасе Х., Сенгелов Л., Робертс Дж. Т., Риччи С., Доглиотти Л., Оливер Т. и др. Результаты долгосрочной выживаемости рандомизированного исследования по сравнению гемцитабина плюс цисплатин с метотрексатом, винбластином, доксорубицином и цисплатином у пациентов с раком мочевого пузыря. Дж. Клин Онкол . 20 июля 2005 г. 23 (21): 4602-8. [Медлайн].

• фон дер Маасе Х., Сенгелов Л., Робертс Дж. Т., Риччи С., Доглиотти Л., Оливер Т. и др. Результаты долгосрочной выживаемости рандомизированного исследования по сравнению гемцитабина плюс цисплатин с метотрексатом, винбластином, доксорубицином и цисплатином у пациентов с раком мочевого пузыря. Дж. Клин Онкол . 20 июля 2005 г. 23 (21): 4602-8. [Медлайн].

• Ивасаки К., Обара В., Като Ю., Таката Р., Танджи С., Фудзиока Т.Неоадъювантный гемцитабин плюс карбоплатин при местнораспространенном раке мочевого пузыря. Jpn J Clin Oncol . 2013 Февраль 43 (2): 193-9. [Медлайн].

• Беллмант Дж., Теодор С., Демков Т., Комяков Б., Сенгелов Л., Даугаард Г. и др. Испытание фазы III винфлунина в сочетании с наилучшей поддерживающей терапией по сравнению с наилучшей поддерживающей терапией после схемы, содержащей платину, у пациентов с запущенной переходно-клеточной карциномой уротелиального тракта. Дж. Клин Онкол . 2009 20 сен.27 (27): 4454-61. [Медлайн].

• Rosenberg JE, Hoffman-Censits J, Powles T., van der Heijden MS, Balar AV, Necchi A, et al. Атезолизумаб у пациентов с местнораспространенной и метастатической уротелиальной карциномой, у которых развилось прогрессирование после лечения химиотерапией на основе платины: одноэтапное многоцентровое исследование фазы 2. Ланцет . 2016 г. 4 марта [Medline].

• Балар А.В., Гальский М.Д., Розенберг Дж.Э., Паулс Т., Петрилак Д.П., Беллмант Дж. И др.Атезолизумаб в качестве терапии первой линии у пациентов с местнораспространенной и метастатической уротелиальной карциномой, не отвечающих критериям цисплатина: одноэтапное многоцентровое исследование фазы 2. Ланцет . 2017 7 января. 389 (10064): 67-76. [Медлайн].

• Powles T, Durán I, van der Heijden MS, et al. Сравнение атезолизумаба с химиотерапией у пациентов с местнораспространенным или метастатическим уротелиальным раком, получавшим лечение платиной (IMvigor211): многоцентровое открытое рандомизированное контролируемое исследование фазы 3. Ланцет . 2018 24 февраля. 391 (10122): 748-757. [Медлайн].

• Шарма П., Рец М., Зифкер-Радтке А., Барон А., Некки А., Бедке Дж. И др. Ниволумаб при метастатической уротелиальной карциноме после терапии платиной (CheckMate 275): многоцентровое одноранговое исследование фазы 2. Ланцет Онкол . 2017 25 января. [Medline].

• Apolo AB, Infante JR, Balmanoukian A, Patel MR, Wang D, Kelly K и др. Авелумаб, антитело против запрограммированного лиганда смерти 1, у пациентов с рефрактерной метастатической уротелиальной карциномой: результаты многоцентрового исследования фазы Ib. Дж. Клин Онкол . 2017 г. 4 апреля. JCO2016716795. [Медлайн].

• Балар А.В., Кастеллано Д., О’Доннелл PH, Гривас П., Вуки Дж., Паулс Т. и др. Пембролизумаб первой линии у пациентов с местнораспространенным и неоперабельным или метастатическим уротелиальным раком, не отвечающим критериям цисплатина (KEYNOTE-052): многоцентровое исследование фазы 2 в одной группе. Ланцет Онкол . 2017 18 ноября (11): 1483-1492. [Медлайн].

• Беллмант Дж., Де Вит Р., Вон Д. Д., Фраде Й, Ли Дж. Л., Фонг Л. и др.Пембролизумаб как терапия второй линии при запущенной уротелиальной карциноме. N Engl J Med . 2017 16 марта. 376 (11): 1015-1026. [Медлайн].

• Loriot Y, et al; Исследовательская группа BLC2001. Эрдафитиниб при местно-распространенной или метастатической уротелиальной карциноме. N Engl J Med . 2019 25 июля. 381 (4): 338-348. [Медлайн].

• Rosenberg JE, O’Donnell PH, Balar AV, McGregor BA, Heath EI, Yu EY, et al. Основное испытание энфортумаба ведотина при уротелиальной карциноме после платины и терапии против запрограммированной смерти 1 / лиганда запрограммированной смерти 1. Дж. Клин Онкол . 10 октября 2019 г. 37 (29): 2592-2600. [Медлайн]. [Полный текст].

• [Рекомендации] Чанг С.С., Бурджиан С.А., Чоу Р., Кларк П.Е., Данешманд С., Конети Б.Р. и др. Диагностика и лечение немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря: Совместное руководство AUA / SUO. AUA. Доступно на https://www.auanet.org/guidelines/bladder-cancer-non-muscle-invasive-guideline. 2020; Дата обращения: 13 октября 2020 г.

• [Рекомендации] Витжес Дж. А., Брюинз Х. М., Катомас Р., Комперат Е. М., Коуэн Н. С., Гакис Г. и др.Рекомендации Европейской ассоциации урологов по мышечно-инвазивному и метастатическому раку мочевого пузыря: Краткое изложение рекомендаций 2020 г. Евро Урол . 2020 Апрель 29. [Medline]. [Полный текст].

• [Рекомендации] Rouprêt M, Babjuk M, Böhle A, et al. Рекомендации Европейской ассоциации урологов по уротелиальным карциномам верхних мочевых путей: обновление 2019 г. Европейская ассоциация урологов. Доступно на http://uroweb.org/guideline/upper-urinary-tract-urothelial-cell-carcinoma/. Дата обращения: 6 мая 2020 г.

• [Рекомендации] Беллмант Дж., Орсола А., Леоу Дж. Дж., Вигель Т., Де Сантис М., Хорвич А. и др. Рак мочевого пузыря: Практические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и последующему наблюдению. Энн Онкол . 2014 Сентябрь 25 Дополнение 3: iii40-8. [Медлайн]. [Полный текст].

• [Рекомендации] Целевая группа превентивных служб США. Заключительная рекомендация: рак мочевого пузыря у взрослых: скрининг. Доступно по адресу https://www.uspreventiveservicestaskforce.org/Page/Document/RecommendationStatementFinal/bladder-cancer-in-adults-screening.Май 2019; Дата обращения: 6 мая 2020 г.

• Клиническая профилактическая служба Рекомендация: рак мочевого пузыря. Американская академия семейных врачей. Доступно по адресу http://www.aafp.org/patient-care/clinical-recommendations/all/bladder-cancer.html. Дата обращения: 6 мая 2020 г.

• Рак мочевого пузыря. Американское онкологическое общество. Доступно по адресу https://www.cancer.org/cancer/bladder-cancer.html. 30 января 2019 г .; Дата обращения: 6 мая 2020 г.

• Flaig TW.Обновления рекомендаций NCCN: Управление мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря. J Natl Compr Canc Netw . 2019 1 мая. 17 (5.5): 591-593. [Медлайн]. [Полный текст].

• Grossfeld GD, Litwin MS, Wolf JS Jr, Hricak H, Shuler CL, Agerter DC, et al. Оценка бессимптомной микроскопической гематурии у взрослых: политика передовой практики Американской урологической ассоциации — часть II: оценка пациента, цитология, маркеры мочеиспускания, визуализация, цистоскопия, оценка нефрологии и последующее наблюдение. Урология . 2001 апр. 57 (4): 604-10. [Медлайн].

• Ploeg M, Kums AC, Aben KK, van Lin EN, Smits G, Vergunst H, et al. Факторы прогноза выживаемости у пациентов с рецидивом мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после лечения с лечебной целью. Clin Genitourin Cancer . 2011 Сентябрь 9 (1): 14-21. [Медлайн].

• Брюинз Х.М., Джаладат Х., Ахмади Х., Шеррод А., Цай Дж., Миранда Г. и др. Случайный рак простаты у пациентов с уротелиальной карциномой мочевого пузыря: комплексный анализ 1476 образцов радикальной цистопростатэктомии. Дж Урол . 2013 г. 23 мая. [Medline].

• Zehnder P, Studer UE, Daneshmand S, et al. Результаты радикальной цистэктомии с расширенной лимфаденэктомией у пациентов с раком мочевого пузыря с лимфатическими узлами, которые не подходят для адъювантной химиотерапии или отказываются от нее. БЖУ Инт . 2014 Апрель 113 (4): 554-60. [Медлайн].

что значит быть «цисгендерным»?

Как термин и понятие «трансгендер» теперь прочно вошел в обиход и общественное сознание.В Австралии только за последние несколько недель появились крупные новости о трансгендерном футболисте Ханне Маунси; Комментарии премьер-министра Скотта Моррисона относительно «гендерных шептунов»; и Университет Западной Австралии отменил выступление американского академика, выступающего против трансгендеров.

«Трансгендер» имеет важный лингвистический аналог, который встречается не так часто, но становится все более распространенным. Термин «цисгендер» (произносится «сис-гендер») относится к людям, гендерная идентичность и выражение которых соответствуют биологическому полу, которому они были назначены при рождении.Например, музыкант Моби сказал, что он «заурядный, цисгендерный, гетеросексуальный мужчина».

«Цисгендерный» был введен, чтобы наш язык был более справедливым и инклюзивным, а также чтобы мы лучше понимали гендерный опыт каждого. Однако у этого термина есть как критики, так и поклонники.

---

Читать далее: Объяснитель: разница между трансгендером и перетаскиванием

---

Каково происхождение этого слова?

Префикс «транс-» происходит от латинского, что означает «напротив» или «на другой стороне».Напротив, приставка «цис-» означает «по эту сторону». Он обычно используется в химии и в связи с географическими особенностями, такими как «цизальпин».

«Цисгендер» было написано в научных журналах в 1990-х годах. Он начал набирать популярность примерно с 2007 года, когда теоретик трансгендеров Джулия Серано обсудила это в своей книге «Девушка для битья». В течение следующего десятилетия активисты, ученые и онлайн-форумы буквально помогали распространять информацию.

Он в основном используется теми, кто чувствителен к вопросам пола и идентичности. Тем не менее, его всеобщее признание и стойкость в качестве термина и концепции были признаны, когда он был добавлен в Оксфордский словарь английского языка в 2015 году.

Цисгендер имеет отношение скорее к полу, чем к сексуальности. Человек может быть цисгендером (часто сокращенно цис) и иметь любую сексуальность. Например, двое мужчин могут быть цисгендерами, но один натурал и один гей.

Поскольку это категория личностной идентичности, просто взглянув на кого-то, трудно понять, относится ли он к цисгендерам.

Моби на фото в 2009 году: он недавно назвал себя «заурядным, цисгендерным, гетеросексуальным мужчиной». Эстела Сильва / EPA

Почему это полезно?

У этого термина есть несколько важных применений. Во-первых, это помогает нам различать сексуальную идентичность и гендерную идентичность. Однако его наиболее важная функция, пожалуй, заключается в том, что наименование чего-либо позволяет нам думать об этом более ясно.

Использование слова для обозначения «просто обычной» гендерной идентичности позволяет нам понять, что на самом деле это конкретная гендерная идентичность сама по себе.Идея о том, что люди являются цисгендерными, показывает, что независимо от того, кто вы, отношения между вашим телом и вашим самоощущением особенные.

Подобное привлечение внимания к гендерным вопросам может также подчеркнуть, что некоторые люди находятся в неблагоприятном положении из-за своей гендерной идентичности. То есть, этот термин может способствовать осознанию того, что людям, не относящимся к цисгендерам, часто бывает тяжелее в нашем обществе, чем тем, кто таковыми. Например, трансгендерные мужчины и женщины сообщают о более высоком уровне физического и словесного насилия, чем цисгендерные люди.

Противники

Несмотря на всеобъемлющий потенциал этого слова, у него также есть много недоброжелателей, которые предупреждают о возможных негативных последствиях. Некоторые считают, что это создает вредное различие между трансгендерами и всеми остальными. В этом смысле этот термин может показаться нелогичным и работать против того, чтобы трансгендеры стали более общепринятыми и нормализованными.

Американская актриса Лаверн Кокс, которая называет себя трансгендером. EPA / ПИТЕР ФОЛИ

Это также может ложно подразумевать, что только трансгендеры испытывают несоответствие между своим телом / полом и своей гендерной идентичностью в любой форме.Например, лесбиянки, геи и бисексуалы, в частности, могут считаться цисгендерами, но испытывают конфликт между своей гендерной идентичностью и тем, как общество ожидает от них выражения своего пола.

Другие определили, что этот термин неправильно описывает интерсекс людей. Поскольку у интерсекс людей нетипичные половые характеристики (например, гениталии, гормоны, репродуктивные железы и / или хромосомы), сложно определить их гендерную идентичность в зависимости от пола, по которому они родились.

---

Читать далее: Необходимо запретить операцию, направленную на то, чтобы сделать интерсекс детей «нормальными»

---

С этой точки зрения цисгендер ограничивает и вызывает разногласия, поскольку указывает на то, что существует только две возможные гендерные идентичности, связанные только с двумя полами.

Наконец, некоторые люди думают, что «цисгендер» не будет полностью интегрирован в общий язык из-за того, насколько необычно произносить и писать по буквам. По этой причине были предложены более четкие термины, такие как «не транс».

По мере того, как наше понимание гендера продолжает меняться, будут меняться и слова, которые мы должны описывать. В идеале эти слова помогут нам исправить неравенство между гендерными идентичностями.

Стереоизомеры

Стереоизомеры


Стереоизомеры

Как определено в предыдущем вводном разделе, изомеры — это разные соединения, имеющие одинаковую молекулярную формулу. Когда группы атомов, составляющие молекулы разных изомеров, связаны между собой принципиально разными Таким образом, мы называем такие соединения конституционными изомерами .Например, в случае с C ₄ H ₈ углеводородов, большинство изомеров являются конституционными. Стенография структуры для четырех из этих изомеров показаны ниже с их Имена ИЮПАК.

Обратите внимание, что двенадцать атомов, составляющих эти изомеры, связаны или связаны очень разными способами. Как и все структурные изомеры, каждое соединение имеет свое название по ИЮПАК. Кроме того, молекулярная формула предоставляет информацию о некоторых структурных особенностях, которые должны присутствовать в изомерах.Поскольку формула C ₄ H ₈ содержит на два атома водорода меньше, чем четырехуглеродный алкан-бутан (C ₄ H ₁₀ ), все изомеры, имеющие этот состав, должны включать кольцо или двойную связь. Пятый возможный изомер формулы C ₄ H ₈ представляет собой CH ₃ CH = CHCH ₃ . Этот будет называться 2-бутен в соответствии с правилами IUPAC; однако внимательное изучение этой молекулы показывает, что она имеет две возможные структуры.Эти изомеры могут быть выделены как отдельные соединения, обладающие характерными и разными свойствами. Здесь они показаны с обозначениями cis и trans.

Структуры связи атомов в этих двух изомерах по существу эквивалентны, единственное различие заключается в относительной ориентации или конфигурации двух метильных групп (и двух связанных атомов водорода) относительно двойной связи. В цис-изомере метильные группы находятся на одной стороне; тогда как они находятся на противоположных сторонах транс-изомера.Изомеры, которые отличаются только пространственной ориентацией составляющих их атомов, называются стереоизомерами . Стереоизомеры всегда требуют, чтобы к названию IUPAC был добавлен дополнительный префикс номенклатуры, чтобы указать их пространственную ориентацию, например, cis (латинское значение на этой стороне) и trans (латинское значение поперек) в 2- бутен случай.




Конфигурационные стереоизомеры алкенов

Двойная связь углерод-углерод образуется между двумя гибридизированными атомами углерода sp ² и состоит из двух занятых молекулярных орбиталей, сигма-орбитали и пи-орбитали.Вращение концевых групп двойной связи относительно друг друга разрушает перекрытие p-орбиталей, которое создает пи-орбиталь или связь. Поскольку пи-связь имеет энергию связи примерно 60 ккал / моль, это сопротивление вращению стабилизирует плоскую конфигурацию этой функциональной группы. В результате некоторые дизамещенные алкены могут существовать в виде пары конфигурационных стереоизомеров, часто обозначаемых цис и транс. Существенным требованием для этой стереоизомерии является то, что каждый углерод двойной связи должен иметь две разные группы заместителей (одна может быть водородом).Это иллюстрируется следующими общими формулами. В первом примере углерод с левой двойной связью имеет два идентичных заместителя ( A ), поэтому стереоизомерия по двойной связи невозможна (изменение направления заместителей на правом атоме углерода дает ту же конфигурацию). В следующих двух примерах каждый атом углерода с двойной связью имеет две разные группы заместителей, и существует стереоизомерия, независимо от того, являются ли два заместителя на одном атоме углерода такими же, как и на другом.

Некоторые примеры этой конфигурационной стереоизомерии (иногда называемой геометрической изомерией) показаны ниже. Обратите внимание, что циклоалкены с числом атомов углерода меньше восьми не могут существовать в стабильной транс-конфигурации из-за деформации кольца. Аналогичное ограничение распространяется на циклоалкины с числом атомов углерода меньше десяти. Поскольку алкины линейны, стереоизомерия, связанная с тройной связью углерод-углерод, отсутствует.

Номенклатура стереоизомеров алкенов

Конфигурационные стереоизомеры типа, показанного выше, нуждаются в дополнительном номенклатурном префиксе, добавленном к названию IUPAC, чтобы указать пространственную ориентацию групп, присоединенных к двойной связи.До сих пор префиксы цис- и транс- служили для различения стереоизомеров; однако не всегда ясно, какой изомер следует называть цис, а какой транс. Например, рассмотрим два соединения справа. Как соединение A (1-бром-1-хлорпропен), так и соединение B (1-циклобутил-2-этил-3-метил-1-бутен) могут существовать в виде пары конфигурационных стереоизомеров (показан один). Как назвать эти стереоизомеры, чтобы конфигурация каждого была однозначно указана? Присвоение цис- или транс-префикса любому из этих изомеров может быть выполнено только произвольным образом, поэтому необходим более строгий метод.Совершенно однозначная система, основанная на наборе правил группового приоритета, назначает Z (немецкий, zusammen для вместе) или E (немецкий, entgegen для противоположного) для обозначения стереоизомеров. В изомерах, проиллюстрированных выше, для которых адекватно обозначение цис-транс, Z эквивалентно цис, а E эквивалентно транс.




Правило последовательности для присвоения конфигураций алкенов Назначьте приоритеты заместителям с двойной связью, глядя на атомы, присоединенные непосредственно к атомам углерода с двойной связью. 1. Чем выше атомный номер ближайшего замещающего атома, тем выше приоритет. Например, H– (Разным изотопам одного и того же элемента назначается приоритет в соответствии с их атомной массой.) ​​ 2. Если два заместителя имеют один и тот же непосредственный атом заместителя, переходите к следующему атому (от двойной связи) до тех пор, пока не будет обнаружено различие. . Например, CH 3 — 2 H 5 — 2 — 2 — 3 O–.

После определения относительных приоритетов двух заместителей на каждом из атомов углерода с двойной связью цис-ориентация пары с более высоким приоритетом обозначается как Z , а транс-ориентация обозначается как E . Применяя эти правила к изомерам соединений A и B, показанным выше, мы приписываем конфигурацию изомера 1-бром-1-хлорпропена как E (Br имеет более высокий приоритет, чем Cl, а CH ₃ более высокий приоритет, чем H ).Конфигурация изомера 1-циклобутил-2-этил-3-метил-1-бутена определена как Z (C ₄ H ₇ имеет более высокий приоритет, чем H, и изопропильная группа имеет более высокий приоритет, чем этильная группа). В следующем примере подробно описывается определение приоритета для более сложного случая.

Линейная формула расширяется, чтобы получить структурную формулу в центре. Корневое название — гептен (самая длинная цепь, включающая оба атома углерода двойной связи), а заместители (выделены красным) добавляются, чтобы дать название ИЮПАК.Чтобы назначить конфигурационный префикс, необходимо определить порядок приоритета заместителей у каждого атома углерода с двойной связью. Для углерода №3 непосредственными замещающими атомами являются хлор и углерод. Хлор имеет более высокий атомный номер и, следовательно, имеет более высокий приоритет (окрашен в зеленый цвет и имеет номер 1). Более удаленный атом брома не фигурирует в этом выборе. Для углерода №4 оба ближайших атома-заместителя являются атомами углерода (окрашены в оранжевый цвет). В результате мы должны смотреть на атомы со следующим более высоким атомным номером в цепи заместителей.Это также углерод, но изопропильная группа имеет два атома углерода (также оранжевого цвета), тогда как пропильная группа имеет только один. Следовательно, порядок приоритета следующий: изопропил (зеленый)> пропил (пурпурный). Поскольку две группы с более высоким приоритетом (# 1) находятся на одной стороне двойной связи, эта конфигурация имеет вид ( Z ).


Циклоалкановые стереоизомеры

Конфигурационные стереоизомеры циклоалканов

Стереоизомеры также наблюдаются в некоторых дизамещенных (и более замещенных) циклических соединениях.В отличие от относительно плоских молекул алкенов, замещенные циклоалканы следует рассматривать как трехмерные конфигурации, чтобы оценить пространственную ориентацию заместителей. По договоренности, химики используют тяжелые клиновидные связи для обозначения заместителя, расположенного выше средней плоскости кольца (обратите внимание, что циклоалканы с более чем тремя атомами углерода не являются плоскими), и штриховую линию для связей с атомами или группами расположен под кольцом. Как и в случае стереоизомеров 2-бутена, двузамещенные стереоизомеры циклоалкана могут быть обозначены номенклатурными префиксами, такими как цис и транс .Стереоизомерные 1,2-дибромциклопентаны, показанные справа, являются примером.
В общем, если любые два атома углерода sp ³ в кольце имеют две разные группы заместителей (не считая других кольцевых атомов), возможна стереоизомерия. Это похоже на схему замещения, которая дает стереоизомеры в алкенах; действительно, можно рассматривать двойную связь как двухчленное кольцо. Четыре других примера такого рода стереоизомерии в циклических соединениях показаны ниже.

Если более двух атомов углерода в кольце имеют разные заместители (не считая других атомов в кольце), стереохимическая запись, позволяющая различать различные изомеры, становится более сложной.

Для примеров того, как такие соединения названы в системе IUPAC.




Три проблемы, касающиеся наименования стереоизомеров алкена.




Конформационные стереоизомеры

Структурные формулы показывают способ, которым атомы молекулы связаны вместе (ее состав), но обычно не описывают трехмерную форму молекулы, если только не используются специальные обозначения связывания (например,грамм. клин и штриховые линии). Важность таких трехмерных описательных формул стала очевидной при обсуждении конфигурационной стереоизомерии, когда относительная ориентация атомов в пространстве фиксируется строением связей молекулы (например, двойными связями и кольцами). Здесь также было отмечено, что при наименовании конкретных стереоизомеров необходимо использовать префиксы номенклатуры. В этом разделе мы расширим наше трехмерное представление о молекулярной структуре, включив в него соединения, которые обычно предполагают набор уравновешивающих трехмерных пространственных ориентаций, которые вместе характеризуют одно и то же выделяемое соединение.Мы называем эти различные пространственные ориентации атомов молекулы, которые возникают в результате вращения или скручивания одинарных связей конформациями .

В случае гексана мы имеем неразветвленную цепь из шести атомов углерода, которую часто записывают в виде линейной формулы: CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₃ . Мы знаем, что это не совсем так, поскольку все атомы углерода имеют тетраэдрическую конфигурацию. Таким образом, фактическая форма удлиненной цепи имеет зигзагообразный характер.Однако происходит легкое вращение углерод-углеродных связей, и шестиуглеродная цепочка легко скручивается, принимая совершенно иную форму. Возможны многие конформации гексана, две из которых проиллюстрированы ниже.

Удлиненная цепь	Скрученная цепь

Для анимации конформационного движения в гексане.




Соответствие этана

Простой алкан этан дает хорошее введение в конформационный анализ.Здесь есть только одна связь углерод-углерод, и предполагаемые вращательные структуры (ротамеры) находятся между двумя крайностями: смещены, и затмеваются . В нижеследующем описании этих конформеров используется несколько структурных обозначений. На первом изображена молекула этана сбоку, причем углерод-углеродная связь расположена горизонтально по отношению к наблюдателю. Затем атомы водорода располагаются в окружающем пространстве посредством клина, (перед плоскостью) и заштрихованных связей (позади плоскости).Если эту структуру повернуть так, чтобы углерод № 1 наклонился вниз и приблизил к зрителю, будет представлена ​​проекция «козлы». Наконец, если зритель смотрит вниз на углерод-углеродную связь с углеродом №1 перед №2, видна проекция Ньюмана.

9034 162 16921 34 Отталкивание связей в этане Экстремальные конформации этана Название Conformer с клиновидной штриховкой Структура связки Sawhorse Структура 62 Чтобы увидеть затмеваемый конформер этана, сориентируйте себя как проекцию Ньюмана, а затем преобразуйте его со ступенчатым конформером и промежуточными конформерами. В результате отталкивания электронов связи, показанного справа выше, затменная конформация менее стабильна, чем ступенчатая, примерно на 3 ккал / моль (затменная деформация). Самые сильные отталкивания в затменной конформации обозначены красными стрелками. Есть шесть других менее сильных отталкиваний, которые не показаны. В шахматной конформации имеется шесть равных отталкиваний связей, четыре из которых показаны синими стрелками, и все они существенно менее серьезны, чем три самых сильных отталкивания после затмения.Следовательно, потенциальная энергия, связанная с различными конформациями этана, изменяется в зависимости от двугранного угла связей , как показано ниже. Хотя конформеры этана находятся в быстром равновесии друг с другом, разница в энергии 3 ккал / моль приводит к существенному преобладанию ступенчатых конформеров (> 99,9%) в любой момент времени. Хотя стерическое отталкивание и / или отталкивание электронов связи остается наиболее популярным объяснением затрудненного вращения этана, молекулярно-орбитальные взаимодействия также были предложены как важный фактор.Для обсуждения этой функции. Профиль потенциальной энергии для этановых конформеров Двугранный угол Анимация выше иллюстрирует взаимосвязь между потенциальной энергией этана и его двугранным углом Соответствие бутана Углеводородный бутан имеет более широкий и более сложный набор конформаций, связанных с его строением, чем этан.Особый интерес и важность имеют конформации, полученные вращением вокруг центральной углерод-углеродной связи. Среди них мы сосредоточимся на двух расположенных в шахматном порядке конформерах ( A и C ) и двух заслоненных конформерах ( B и D ), показанных ниже в нескольких стереопредставлениях. Как и в случае этана, ступенчатые конформеры более стабильны, чем затененные конформеры на 2,8–4,5 ккал / моль. Поскольку расположенные в шахматном порядке конформеры представляют собой главные компоненты образца бутана, им были присвоены идентификационные обозначения префикса анти для A и gauche для C. Четыре конформера бутана Следующая диаграмма иллюстрирует изменение потенциальной энергии, которое происходит при вращении вокруг связи C2 – C3. Модель справа показана в конформации D , и, щелкнув любую из цветных точек данных на кривой потенциальной энергии, она изменится на конформер, соответствующий этой точке. Полный поворот будет отображаться при включении анимации.Этой моделью можно управлять, перетаскивая мышь для просмотра с любой точки зрения. Профиль потенциальной энергии для конформеров бутана Модель Spacefill Рукоять Модель /> Включение / выключение анимации В настоящее время полезно суммировать некоторые важные аспекты конформационной стереоизомерии. (i) Большинство конформационных взаимопревращений в простых молекулах происходит быстро при комнатной температуре. Следовательно, выделение чистых конформеров обычно невозможно. (ii) Для конкретных конформеров требуются специальные термины номенклатуры, такие как в шахматном порядке , затмеваемые , gauche и анти , когда они обозначены. (iii) Специфические конформеры также могут быть обозначены двугранными углами. В конформерах бутана, показанных выше, двугранные углы, образованные двумя метильными группами вокруг центральной двойной связи, составляют: A 180º, B 120º, C 60º и D 0º. (iv) Ступенчатые конформации одинарных углерод-углеродных связей более стабильны (имеют более низкую потенциальную энергию), чем соответствующие затмеваемые конформации. Более высокая энергия затменных связей известна как затмевающая деформация . (v) В бутане гош-конформер менее стабилен, чем антиконформер, примерно на 0,9 ккал / моль. Это происходит из-за скопления двух метильных групп в гош-структуре и называется стерическим штаммом или стерическим препятствием . (vi) Конформеры бутана B и C имеют неодинаковые зеркальные структуры, в которых двугранные углы по часовой стрелке составляют 300º и 240º соответственно. Эти пары энергетически одинаковы и не различаются на диаграмме потенциальной энергии, показанной здесь. Для более подробного обсуждения анализа ротамеров щелкните здесь. Эта страница является собственностью Уильяма Ройша. Комментарии, вопросы и ошибки следует быть отправленным по адресу whreusch @ msu.edu. Эти страницы предоставляются IOCD для оказания помощи в наращивании потенциала в области химического образования. 05.05.2013 . Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт