Сообщение про сперанского кратко: Сперанский Михаил Михайлович, история жизни, значимые события и заслуги

Содержание

Сперанский Михаил Михайлович, история жизни, значимые события и заслуги

Граф Михаил Михайлович Сперанский (1772-1839) вошел в историю как великий русский реформатор, основатель российской юридической науки и теоретического правоведения. Его практическая деятельность во многом была связана с реформированием государственно-правовой системы Российской империи. Концепция Сперанского легла в основу знаменитого указа Александра I «О свободных (вольных) хлебопашцах» (1803 г.), согласно которому помещики получили право отпускать крепостных на «волю», наделяя их землей.

М.М. Сперанский родился в семье сельского священника, а образование получил в Петербургской Духовной академии. После завершения обучения состоял в ней профессором математики, физики и красноречия в период 1792-1795 гг., а позже профессором философии и префектом академии. Учебная и административная деятельность Сперанского продолжалась вплоть до 1797 г., когда он перешел на службу в Сенат.

Карьеру Сперанского во многом определила его близость к князю А.Б. Куракину. Как только князь был назначен генерал-прокурором Сената, он склонил Сперанского перейти туда на службу и быстро повысил его до чина коллежского советника и должности экспедитора. Несмотря на подозрительность Павла I и быструю смену генерал-губернаторов - Куракин, затем П.В. Лопухин, А.А. Беклешов и, наконец, в 1801 г. П.Х. Обольянинов - Сперанскому сохранял своё положение благодаря высокому профессионализму. Одновременно Михаил Михайлович являлся секретарем Комиссии по снабжению столицы продовольствием, которую возглавлял наследник престола Александр Павлович. Именно здесь произошло знакомство будущего императора с М.М. Сперанским.

12 марта 1801 г. Александр I вступил на престол, а уже 19 марта Сперанский был назначен статс-секретарём государя.  На данном этапе своей политической карьеры Сперанский выступает автором и редактором многих указов и распоряжений, которые были основой для реформаторского курса императора Александра. К ним относятся восстановление Жалованной грамоты дворянству и Жалованной грамоты городам; отмена телесного наказания священников и дьяконов; ликвидация тайной экспедиции; дозволение ввоза из-за границы книг и нот; восстановление права открывать частные типографии; многочисленные помилования.

Сперанский стал автором проекта преобразования системы органов государственной власти, заняв в 1802 г., в только что образованном Государственном Совете, пост начальника экспедиции гражданских и духовных дел. Вскоре по ходатайству Министра внутренних дел В.П. Кочубея, Сперанский получил должность правителя канцелярии министерства. С 1802 по 1807 гг. Кочубей занимает пост министра, и в сотрудничестве со Сперанским осуществляется ряд нововведений в либеральном духе, в том числе издаются указ о свободных хлебопашцах, разрешение вольного соляного промысла, проводится преобразование медицинского и почтового дел. Деятельность Сперанского в Министерстве была замечена императором Александром I, который назначил его повторно статс-секретарем. В 1808 г. Сперанский сопровождал Александра в Эрфурт на встречу с Наполеоном и в том же году представил свой проект общей политической реформы на рассмотрение императора.

Государственный муж Сперанский, плохо разбирался в придворных интригах и отношениях внутри двора. По его инициативе был введен экзамен для чиновников, а также отменена придворная служба, а все придворные звания становились лишь почётными титулами и не более того. Все это вызывало раздражение и ненависть двора. В день своего 40-летия Сперанский был удостоен орденом Александра Невского. Однако ритуал вручения прошёл непривычно строго, и стало ясно, что «звезда» реформатора начинает тускнеть. Недоброжелатели Сперанского (среди которых был шведский барон Густав Армфельд, председатель комитета по делам Финляндии, и А.Д. Балашов, руководитель Министерства полиции) ещё больше активизировались. Они передавали Александру все сплетни и слухи о госсекретаре. Вместе с тем самоуверенность самого Сперанского, его неосторожные упреки в адрес Александра I за непоследовательность в государственных делах, в конечном счете, переполнили чашу терпения и вызвали раздражение императора.Современники назовут эту отставку «падением Сперанского». В действительности произошло не простое падение высокого сановника, а падение реформатора со всеми вытекающими отсюда последствиями.Сперанский в 1812 г. был обвинен в измене, арестован, уволен со всех должностей и сослан в Пермь, откуда вскоре переведен под надзор полиции в свое небольшое имение Великополье Новгородской губернии. Поначалу он вынужден был закладывать царские подарки и пожалованные ему ордена для того, чтобы обеспечить себе хоть сколько-нибудь достойное проживание.

Опала М.М. Сперанского окончилась в 1816 г. и его назначили губернатором в Пензу, где он прожил около трех лет и предпринял энергичные меры по наведению порядка. В 1819 г. Сперанский стал сибирским генерал-губернатором с чрезвычайными полномочиями для производства ревизии. В 1821 г. он вернулся в Санкт-Петербург с результатами ревизии и с проектом нового Уложения для Сибири. Его планы были утверждены, сам он щедро награжден и назначен членом Государственного Совета и начальником Комиссии о гражданском уложении.

После воцарения Николая IСперанскому было поручено составить полный свод законов Российской Империи от времен правления Алексея Михайловича до Александра I. Эту задачу Сперанский выполнил в 4 года (1826-1830 гг.). За свою государственную деятельность в 1839 г., незадолго до смерти, Сперанский был пожалован титулом графа.

Краткая биография и основные этапы карьеры Михаила Сперанского

Сперанский Михаил Михайлович (1772—1839), российский государственный и политический деятель, граф (1839 г.).

Родился 12 января 1772 г. в селе Черкутине (ныне во Владимирской области) в семье священника.

В 1791 г. окончил Александро-Невскую семинарию в Петербурге, где был оставлен в качестве преподавателя.

С 1797 г. Сперанский находился на государственной службе, составил несколько проектов преобразований.

В 1807 г. он стал статс-секретарём Александра I, в 1808 г. — членом Комиссии составления законов и товарищем (заместителем) министра юстиции. По поручению императора им был написан план государственных реформ (1809 г.).

Программа Сперанского предусматривала придание политическому строю формы конституционной монархии: разделение властей, предоставление гражданам ряда прав, создание законодательной Государственной думы, распорядительных окружных и губернских дум и Государственного совета — высшего совещательного органа при императоре. Предполагалась постепенная отмена крепостного права.

В итоге осуществились лишь немногие из намеченных мероприятий.

В 1812 г. из-за обвинения в связях с Наполеоном I реформатор был сослан в Нижний Новгород под надзор полиции, позже — в Пермь.

В 1816 г. он стал пензенским гражданским губернатором, в 1819 г. — генерал-губернатором Сибири.

В 1821 г. Сперанский был возвращён в Петербург, назначен членом Государственного совета и управляющим Комиссии составления законов. К этому времени он являлся уже сторонником неограниченной монархии.

В 1826 г. входил в состав Верховного уголовного суда над декабристами.

С 1826 г. фактически возглавлял Второе отделение собственной Его Императорского Величества канцелярии. Под руководством Сперанского были подготовлены Полное собрание законов Российской империи в 45 томах (1830 г.) и Свод законов Российской империи в 15 томах (1832 г.).

С 1839 г. — граф.

Умер 23 февраля 1839 г. в Петербурге.

Еще по теме:

Популярно:

Комментарии:

Реформаторская деятельность Михаила Михайловича Сперанского

Михаил Михайлович Сперанский (1772-1839) — российский политический, общественный деятель, автор многочисленных работ по праву и юриспруденции, автор крупных законопроектов и реформ.

Сперанский жил и работал во времена правления Александра 1-го и Николая 1-го, являлся действующим членом Академии наук, занимался общественной деятельностью и реформированием правовой системы Российской империи. При Николае 1-м был воспитателем наследника престола — Александра Николаевича. Сперанский написал множество теоретических работ по юриспруденции и считается одним из родоначальников современного права. Кроме того, он составил проект конституции.

Краткая биография Сперанского

Родился во Владимирской губернии в семье церковного причетника. С раннего детства обучался грамоте и читал священные книги. В 1780 г. Сперанский поступил во Владимирскую семинарию, где вскоре благодаря своему острому уму и необычайно сильным способностям к аналитическому мышлению стал лучшим учеником. После окончания семинарии Сперанский продолжил свое образование там же, но уже в качестве студента. За свои успехи в учебе он получил возможность перевестись в Александро-Невскую семинарию в Петербурге, после окончания которой остался там преподавать.

Преподавательская деятельность Сперанского в семинарии продлилась относительно недолго. В 1795 г. он получил предложение стать секретарем князя Куракина. Так началась политическая карьера Сперанского.

Сперанский быстро продвигался по служебной лестнице. В 1801 г. он стал действительным статским советником, что позволило ему более активно участвовать в общественно-политической жизни страны. В 1806 г. Сперанский познакомился с императором Александром 1-м и так впечатлил его своими талантами и умом, что получил предложение заняться разработкой проекта реформ, которые могли бы улучшить состояние страны. В 1810 г. Сперанский стал государственным секретарем (второй в стране человек после государя), началась его активная реформаторская деятельность.

Реформы, предложенные Сперанским, задевали интересы слишком многих слоев общества и были настолько обширными, что дворянство их опасалось. В результате в 1812 г. Сперанский попал в опалу и находится в таком жалком положении вплоть до 1816 г.

В 1819 г. он неожиданно получил должность генерал-губернатора Сибири, а уже в 1821 г. вернулся в Петербург.

Император Александр 1-й умер, а на престол взошел его брат, Николай 1-й. Сперанский познакомился с Николаем и тоже очаровал его своим умом, что позволило ему вернуть себе бывшее политическое влияние и уважение. В это время Сперанский получил должность воспитателя наследника престола. Открылась Высшая школа правоведения, в которой он активно работал.

Сперанский умер в 1839 г. от простуды.

Политические реформы Сперанского

Сперанский получил широкую известность благодаря своим многочисленным реформам, которые носили всеобъемлющий характер. Сперанский не был сторонником монархического строя, он полагал, что государство должно давать всем гражданам одинаковые права, а власть должна быть поделена, однако в то же время он был уверен, что Россия пока не готова к столь радикальным переменам, поэтому предлагал, как ему казалось, более подходящий вариант. По приказу Александра 1-го Сперанский разработал программу реформ, которые должны были помочь России выбраться из кризиса.

Сперанский предлагал следующие идеи:

  • получение гражданами вне зависимости от сословия равных гражданских прав;
  • существенное сокращение всех расходов на деятельность государственных органов и чиновничества, а также установление жесткого контроля над бюджетом;
  • разделение власти на законодательную, исполнительную и судебную, перестройка системы министерств и изменение их функций;
  • создание более современных судебных органов, а также написание нового законодательства, которое учитывало бы потребности новой системы управления;
  • обширные преобразования во внутренней экономике, введение налогов.

Основная идея реформ Сперанского заключалась в том, чтобы создать демократичную модель управления во главе с монархом, которому, однако, власть не будет принадлежать единолично, а общество будет уравнено перед законом. По проекту Россия должна была стать полноценным правовым государством.

Реформы Сперанского не были приняты дворянством, которое боялось потерять свои привилегии. Проект был выполнен не полностью, в жизнь были воплощены лишь некоторые его пункты.

Итоги деятельности Сперанского

Итоги деятельности Сперанского:

  • значительный рост внешней торговли за счет повышения экономической привлекательности России в глазах иностранных инвесторов;
  • модернизация системы управления государством; реформирование армии чиновников и сокращение расходов на их содержание;
  • появление мощной экономической инфраструктуры, которая позволяла экономике саморегулироваться и быстрее развиваться;
  • создание современной правовой системы; Сперанский стал автором-составителем «Полного собрания законов Российской империи»;
  • создание теоретической основы современного законодательства и права.

Родился крупнейший государственный и общественный деятель, реформатор Михаил Михайлович Сперанский

1 (12) января 1772 г. в селе Черкутино Владимирской губернии (Собинский район Владимирской области) в семье священника родился Михаил Михайлович Сперанский, граф, общественный и государственный деятель, почётный член Императорской Академии Наук и действительный член Императорской Российской академии; ближайший советник императора Александра I, автор плана либеральных преобразований, инициатор создания Государственного совета и руководитель кодификации основных государственных законов Российской империи.

Михаил Михайлович окончил Владимирскую семинарию, при поступлении в которую получил фамилию Сперанский (от лат. «sperare» — надеяться). Как лучший ученик, Сперанский был направлен в семинарию при Александро-Невской лавре в Петербурге и в 1792 г., окончив курс, был оставлен в ней в качестве профессора математики, физики и красноречия. В 1795 г. он был назначен префектом (начальником) семинарии. В 1797 г. Сперанский ушёл из семинарии и поступил на службу в канцелярию генерал-прокурора.

В 1801 г. Сперанский получил чин действительного тайного советника и занялся составлением различных государственных указов и манифестов. В 1803 году по поручению Александра I Михаил Сперанский составил «Записку об устройстве судебных и правительственных учреждений в России», в которой проявил себя как сторонник постепенного преобразования самодержавия в конституционную монархию на основе продуманного плана. В 1803-1807 гг. Михаил Михайлович служил в Министерстве внутренних дел. В эти годы он написал работы, выдвинувшие его в ряд первых политических мыслителей того времени: «Размышления о государственном устройстве империи», «О духе правительства». В 1807 г. он стал статс-секретарём императора, а в 1808 г. сопровождал Александра I в Эрфурт для встречи с Наполеоном Бонапартом, который назвал Сперанского «единственной светлою головою в России».

В 1809 г. по поручению Александра I Сперанский составил план государственных преобразований — «Введение к уложению государственных законов». Это был проект реформ, которые должны были быть проведены сверху и сохраняли при этом самодержавную власть царя. В плане Сперанского была разработана стройная система центрального и местного управления, основанная на принципе разделения властей — законодательной, исполнительной и судебной. Вводилась выборность в распорядительные и исполнительные органы власти, но участие в управлении было предоставлено лишь лицам, обладавшим определённым имущественным цензом. Высшим распорядительным органом являлась Государственная дума, на местах — соответственно губернская, уездная и волостная думы. По такому же принципу формировались и органы исполнительной власти. Учреждался также и другой верховный орган, призванный объединить деятельность законодательной, исполнительной и судебной властей, — Государственный совет, законосовещательное учреждение при императоре. Члены в него не избирались, а назначались самим императором.

В своей реформе М. М. Сперанский уделил большое внимание и тем, кто составлял управленческий аппарат. Почти один за другим вышли указы, которые ясно и твёрдо выражали требования, каким должны удовлетворять служащие в правительственных учреждениях. Закон требовал исполнителей «опытом и постепенным прохождением службы приуготовленных, минутными побуждениями не развлекаемых», по выражению указа от 3 (15) апреля 1809 г., «исполнителей сведущих, обладающих твердым и отечественным образованием», т. е. воспитанных в национальном духе, возвышающихся не выслугой лет, а «действительными заслугами и отличными познаниями», говорится в указе от 6 (18) августа 1809 г.

Александр I признал проект Сперанского «удовлетворительным и полезным», но некоторые сенаторы, министры и другие высшие сановники считали его слишком радикальным и «опасным». Александр I пошёл навстречу их требованиям, и проект был отклонён. Удалось осуществить лишь некоторые части плана Сперанского: 1 (13) января 1810 г. был учреждён Государственный совет, а в 1811 г. завершена реорганизация министерств.

В 1812 г. в результате интриг и доносов Сперанский был обвинён в измене и сослан в Нижний Новгород под строгий надзор полиции, а затем переведён в Пермь. После ряда писем Александру I в 1816 г. Сперанский был назначен пензенским гражданским губернатором, а спустя три года стал генерал-губернатором Сибири. Итогом деятельности Сперанского на посту сибирского генерал-губернатора стало фундаментальное «Уложение для управления Сибирью», детально рассматривающее устройство, управление, судопроизводство и экономику этой части Российской империи.

Весной 1821 г. Михаил Михайлович был возвращён в Петербург.

После вступления на престол императора Николая I, Сперанский являлся членом Верховного уголовного суда над декабристами, а затем возглавил масштабную работу по кодификации законов. Под его руководством были составлены Полное собрание законов Российской империи в 45-ти томах и Свод законов Российской империи в 15-ти томах. В награду за эту работу он получил орден Святого Андрея Первозванного.

Сперанский также являлся членом ряда высших государственных комитетов; в 1835-37 гг. — преподавал юридические науки наследнику престола, будущему императору Александру II, а с 1838 г. был председателем департамента законов Государственного совета.

1 (12) января 1839 г., в день 67-летия, Михаилу Михайловичу Сперанскому было пожаловано графское достоинство, однако спустя всего 41 день, 11 (23) февраля, граф-реформатор скончался от простуды. М. М. Сперанский был погребён на Тихвинском кладбище (ныне Некрополь мастеров искусств) Александро-Невской лавры.

Лит.: Записка М. М. Сперанского о вероятностях войны с Францией после Тильзитского мира // Русская старина. 1900. Т. 101. № 1. С. 58-65; То же [Электронный ресурс]. URL: http://www.museum.ru/museum/1812/Library/Rs9/rs9.txt; Минаева Н. В. М. М. Сперанский в воспоминаниях современников: конец XVII — первая половина XIX веков. М., 2009; Нольде А. Э. М. М. Сперанский. М., 2004; Пыпин А. Н. Общественное движение в России при Александре I. СПб, 1871; Сперанский М. М. Правила высшего красноречия. СПб., 1844; Томсинов В. А. Сперанский. М., 2006; Троицкий Н. А. Под скипетром Александра I: Проекты М. М. Сперанского // Россия в XIX веке: Курс лекций. М., 1997.

См. также в Президентской библиотеке:

Государственная деятельность М. М. Сперанского: коллекция;

Сперанский Михаил Михайлович (1772-1839) // Государственная власть: коллекция;

Довнар-Запольский М. В. Политические идеалы М. М. Сперанского (1904 г.) // Из истории общественных течений в России. Киев, 1910;

Лопухин И. В. Автографы Императорской Публичной библиотеки: Вып. 1: Письма И. В. Лопухина к М. М. Сперанскому. М., 1872;

Международные правовые чтения им. М. М. Сперанского: Президентская библиотека им. Б.Н. Ельцина, 1 октября 2010 г.: [материалы]. СПб., 2010;

Милорадович Г. А. Три письма графа Михаила Михайловича Сперанского... к А. Г. Милорадовичу // Воспоминание об Александре Григорьевиче Милорадовиче. Чернигов, 1868;

Опись бумаг М. М. Сперанскаго 1812 года, изданная под редакцией князя Н. В. Голицына // Труды Комиссии по изданию сочинений, бумаг и писем графа М. М. Сперанского. Вып. 1. Петроград, 1916;

Сперанский М. М. Обозрение исторических сведений о своде законов: составлено из актов, хранящихся во 2-м Отделении Собств. Е. И. В. канцелярии. СПб., 1833.

Материал подготовлен при участии Пензенской областной библиотеки им. М. Ю. Лермонтова

Сперанский, Михаил Михайлович | ИРКИПЕДИЯ

Среди выдающихся государственных деятелей России XIX века одно из первых мест принадлежит М.М. Сперанскому. Безродный выходец из «жеребячьего сословия», благодаря природному уму и трудолюбию Сперанский в короткий срок сделал блестящую карьеру, познал высочайшие взлеты и горечь падения, оставив по себе память признанного реформатора и выдающегося юриста. По воле судеб оказавшись в 1819 генерал–губернатором в огромном зауральском крае, Сперанский и здесь занялся реформами, благодатное влияние которых сибиряки ощущают и сегодня. Бескорыстное стремление к благу страны надолго останется в людской памяти.

Отправляя Сперанского в Сибирь, Александр I наделил его небывалыми полномочиями. Сперанский ехал в Сибирь в двух лицах – как ревизор и как «главный начальник края», которому поручалось провести ревизию, «придать кого нужно законному суждению», сообразить «на месте полезнейшее устройство сего отдаленного края и сделать оному начертание на бумаге». Весной 1819 г. Сперанский пересек границу Сибири. Первый сибирский город Тюмень произвел на него вид «печальный», в Тобольске – древней столице Сибири – ревизор тоже не задержался. Он спешил в далекий и загадочный Иркутск, как бы предчувствуя, что именно там находится «корень зла». Добравшись наконец до Иркутска, Сперанский через несколько дней напишет ставшие впоследствии знаменитыми строки.

«Если в Тобольске я отдал всех под суд... то здесь оставалось бы всех повесить».

К приезду нового генерал–губернатора Иркутск готовился как никогда. Горожанам надолго запомнилась встреча. Основные сооружения города – Кафедральный собор, Триумфальные ворота и главные улицы – Большая и Заморская – были буквально залиты огнями. Па переправе через Ангару гремел оркестр, а среди огромного стечения народа выделялись губернатор Н.И. Трескин с чиновниками в парадных мундирах и орденах. В дневнике Сперанский так описал первые впечатления об Иркутске: «Вид освещенного города из–за реки был великолепен». Однако уже первое знакомство с результатами управления краем И.Б. Пестелем и Трескиным потрясло Михаила Михайловича. «Чем дальше опускаюсь я на дно Сибири, тем более нахожу зла, и зла почти нестерпимого», – писал он.

Приступая к ревизии, Сперанский был хорошо знаком с укоренившимся в правительственных кругах с Екатерининских времен мнением о том, что все сибиряки – ябедники. А потому обращать внимание на их прощения и жалобы не стоит. С большим трудом он смог убедить жителей губернии в том, «что жалобы на местное начальство не составляют преступления». И тогда... жалобы посыпались, как из рога изобилия. Число их доходило до трехсот в день. В Иркутске в считанные дни была раскуплена вся гербовая бумага, на которой следовало писать жалобы.

Губернатор Трескин был, по характеристике Сперанского, человек «наглый, смелый, неглупый», но «худо воспитан» и «хитер и лукав, как демон». Под стать ему была и стая чиновников рангом пониже: Верхнеудинский исправник М.М. Геденштром, Иркутский – Войлошников, Нижнеудинский – Лоскутов.

Ревизия вскрыла вопиющую картину злоупотреблений и произвола местной администрации. Сам ревизор писал, что общим предметом «следственных дел стало лихоимство во всех его видах». Трескин был отдан под суд, вместе с ним в различных злоупотреблениях оказалось замешано около семисот чиновников рангом пониже. Сперанский в короткий срок смог вычистить «авгиевы конюшни». В этом его несомненная заслуга.

Быт нашего героя в Иркутске был организован очень скромно. Вместе с приехавшими с ним молодыми чиновниками – Г.С. Батеньковым, К.Г. Репинским, Ф.И. Цейером и другими, они жили и работали в простом, но не очень уютном доме А.А. Кузнецова, расположенном отнюдь не в центре Иркутска, а на окраине, недалеко от реки Ушаковки. Единственной достопримечательностью этого дома был заброшенный сад, ставший любимым местом прогулок Сперанского и сопровождавших его молодых людей. По воскресеньям Сперанский присутствовал на обедне в приходской церкви, любил выехать за город на речку Каю, а к вечеру запросто заглянуть на огонек к знакомым купцам. Уже много лет спустя старожилы Иркутска вспоминали прогуливавшегося на свежем воздухе в любую погоду высокого, чуть сутулого человека, одетого в простую шинель без всяких знаков отличия, скромную кожаную кепку. Трудно было ощутить в этом одиноком страннике выдающегося мыслителя, в обмен на которого Наполеон предлагал Александру I отдать любое из принадлежащих ему государств Европы.

Основным делом Михаила Михайловича в период его двухлетнего пребывания в Иркутске стала не ревизия, а разработка проектов будущей реформы, вошедших в литературу под общим названием «сибирского учреждения» или «сибирских реформ» 1822 г. Сперанский и его «конфиденты» через Сибирский комитет представили на рассмотрение Александру I пакет предложений, состоящий из 10 законопроектов: «Учреждение для управления Сибирских губерний»; «Устав об управлении инородцев»; «Устав о ссыльных»; «Устав об этапах»; «Устав об управлении киргиз–кайсаков»; «Устав о сухопутных сообщениях»; «Устав о городовых казаках»; «Положение о земских повинностях»; «Положение о хлебных запасах»; «Положение о долговых обязатель­ствах между крестьянами и между инородцами», которые были утверждены царем 22 июня 1822 г. Новую систему управления Сибири Сперанский попытался построить на компромиссе интересов верховной, т. е. самодержавной, власти с региональными особенностями и отчетливом понимании невозможности в тот период времени полностью подчинить Сибирь действию общеимперского законодательства.

Правительство со времен Екатерины II на разных уровнях традиционно признавало существенные особенности Сибирского края. Одним из проявлений этого стало намерение Екатерины сделать специальную оговорку о нераспространении губернских учреждений 1775 г на Сибирь. В 1801 г., отправляя И.О. Селифонтова с ревизией в Сибирь, Александр I прямо заявил в указе: «Мы находим, что сибирский край по пространству своему, по разностям естественного его положения, по состоянию народов, его населяющих... требует... в разделении его... и в самом образе управления особенного постановления», основанного «на достоверном познании местных обстоятельств». Но наиболее ярко мысль о необходимости особой формы управления для Сибири прозвучала в отчете М.М. Сперанского по обозрению края. Вдумчивый ревизор на страницах документа к этой идее возвращается неоднократно. В конечном итоге он приходит к выводу о том, что Сибирь по пространству своему «требует особенных постановлений».

В сибирском законодательстве 1822 г. прежде всего обращают на себя внимание его тщательная предварительная подготовка. М.М. Сперанским и его помощниками, в первую очередь Г.С. Батеньковым; был собран и проанализирован огромный комплекс исходных материалов. Итоговый «пакет» законов в утвержденном виде не только поражает своим объемом – он состоит из 4019 параграфов, – но и отличается исключительно высоким для того времени качеством проработки правовых актов. Наиболее характерной его чертой стало стремление Сперанского обеспечить в новом законодательстве сочетание основополагающих политических принципов функционирования империи, сибирской специфики с решением общегосударственных задач.

Регионализм М.М.Сперанского проявился прежде всего в разделении Сибири на два генерал–губернаторства – Западной и Восточной Сибири. Тем самым по существу было положено начало тому административному разделению Сибири, которое сохранилось и по сей день. Региональными мотивами было навеяно предложение о создании двух Главных управлений и совещательных органов при них – советов. Этот же механизм вводился на уровне губернии и округов (уездов). Создание Сперанским системы противовеса единоличной власти является, как представляется, уникальным явлением в российском законодательстве первой половины XIX в. Значительно позже, в 1860–х гг., нечто похожее можно наблюдать в других генерал–губернаторствах Азиатской России, например, в Туркестане. Однако в тот период времени это было принципиальным новшеством в законодательной практике, навеянным традиционным стремлением сибирской бюрократии к «самовластию». Коллегиальные советы и должны были, по замыслу Сперанского, стать гарантами законности принимаемых решений. Обращает на себя внимание состав Главных управлений, в которые под председательством генерал–губернатора входило по шесть чиновников: трое по назначению самого главного начальника края, а трое представляли интересы министерства внутренних дел, финансов и юстиции. В таком механизме формирования советов нашли сочетание принципы отраслевого, территориального и общегосударственного уровней управления, централизаторские и децентрализаторские тенденции. Эти же основы были зафиксированы в статьях закона, определяющих взаимоотношения генерал–губернатора с общегосударственными ведомствами, представленными в регионе: жандармской и почтовой службами, кабинетскими чиновниками, казенными палатами и др.

Региональные мотивы особенно сильно проявились при разработке «Устава об управлении инородцев». Факт появления в российском законодательстве новой сословной категории – тому доказательство. Само слово «инородцы» в практику русского языка, в юридическую лексику вводится именно Сперанским. Оно отразило эволюцию взаимоотношений правительства с народами Сибири, глубину инкорпорации сибирских аборигенов в общегосударственные политические, экономические и социокультурные механизмы и процессы. Здесь уместно отметить, что на протяжении трехсотлетней истории досоветской Сибири официальное название народов края неоднократно менялось. В XVII в. коренных жителей Сибири называли «ясашными иноземцами», так как Сибирь и ее население еще только начинали входить в состав Российского государства. Однако по мере утверждения в подданстве они переставали быть иноземцами. В XVII и в первые десятилетия XIX в. сибирских аборигенов обычно называли «ясачными иноверцами», т. е. людьми иной, отличной от христианства религии. В XIX в. в связи с распространением православия среди народов Сибири это название исчезает как неточно отражающее конфессиональную принадлежность аборигенов. Сперанский вводит новый термин – «инородцы», который стал официальным названием народов края и приобрел сословный характер. Таким образом, в самом термине «инородцы» заметны элементы региональной специфики, связанной с изменением юридического и социального статуса этих народов в составе российского государства. В этом же документе обращает на себя внимание и ряд других положений, связанных с сибирской спецификой: разделение аборигенов на три категории – оседлых, кочевых и бродячих, предполагаемая кодификация норм обычного права – с одной стороны, и возможная интеграция аборигенов в общероссийскую административную и экономическую систему – с другой.

Стремление Сперанского учитывать региональные особенности легко прослеживаются и на примере анализа других законов, составляющих комплекс «сибирского учреждения». Примером тому является регламентация податей и сборов, создание государственных запасов хлеба, заключение торговых сделок и т.д.

Вместе с тем нельзя не заметить, что правовой регионализм Сперанского базировался на имперском законодательстве, его постулатах и имел строго дозированные пределы. В «сибирском учреждении» 1822 г. легко прослеживаются идеи Екатерининского Учреждения о губерниях 1775 г., провозгласившего принцип единоначалия в лице генерал–губернатора как исключительно доверенной от императора особе. Сперанский вовсе не собирался ограничивать генерал–губернаторскую власть. В условиях абсолютной монархии это было невозможно, да Сперанский и не желал этого. Однако он попытался поставить деятельность региональной власти в строго определенные рамки законодательства, что явилось несомненным новшеством для региона и империи в целом.

В то же время сам факт наличия генерал–губернаторской власти, пределы и существо которой не были четко прописаны в законодательстве, осложнял вопрос о подчинении ей учреждений различных ведомств, порождал нежелательные, с точки зрения правительства, дискуссии и вопросы. Представляется, что генерал–губернаторская власть вносила определенный элемент децентрализации в систему управления, что явилось прямым порождением противоречий внутренней политики самодержавия в первой половине XIX в. «Непоследовательность Александра по делам внутреннего благоустройства сказывалась на всех мероприятиях». Так охарактеризовал великий князь Николай Михайлович внутреннюю политику своего венценосного предка.

В такой характеристике видится нам прежде всего сочетание имперских принципов и регионализма в законодательстве 1822 г. В этом смысле «сибирское учреждение» вполне вписывалось в палитру общероссийского законодательства об управлении окраинами государства, т.е. находилось в русле общегосударственной политики. Как известно, в 1809 г. Финляндия, бывшая шведская провинция, после присоединения к России получила автономный статус Великого княжества Финляндского, положение которого было весьма привилегированным даже «по сравнению с коренными областями империи». В декабре 1815 г. император Александр I «даровал конституцию Польше», считавшейся по тем временам верхом либерализма в Европе. На Кавказе, который представлял собой весьма пестрый конгломерат этносов и религий, проводится административная реформа, имевшая целью прочнее увязать этот важный в стратегическом отношении регион с Россией, но в тоже время построенная с учетом местных этнических, религиозных и иных традиций. Расширение территории государства и как следствие, усложнение внутриполитических, в том числе и управленческих, задач, выдвигали перед правительством задачу поиска путей инкорпорации новых территорий в общеимперское пространство. Одним из таких способов и стала разработка регионально–территориального законодательства, в котором отчетливо отражались геополитические особенности конкретных территорий. Сибирское законодательство 1822 г., основы которого были разработаны в Иркутске, логично вписывалось и дополняло доктрину окраинной политики самодержавия. Оно стало первым опытом комплексного регионального законодательства в империи, действовавшим без существенных изменений вплоть до конца XIX века и опередившим общероссийскую кодификацию на десять лет.

Дамешек Л.М. Личность в истории Сибири XVIII-XX веков: Сб. биограф. очерков. — Новосибирск, 2007. — С. 34-40.

Реформы Сперанского кратко.

Александр I желал России либеральных реформ. С этой целью был создан «негласный комитет», а главным помощником императора стал Михаил Михайлович Сперанский.

М. М. Сперанский – сын сельского священника, ставший секретарем императора без протекции, обладал множеством талантов. Он много читал и знал иностранные языки.

По поручению императора Сперанский выработал проект реформ, призванных изменить систему управления в России.

Проект реформ Сперанского.

М. Сперанский предполагал следующие изменения:

  • ввести принцип разделения властей на законодательную, исполнительную и судебную;
  • ввести местное самоуправление трёх ступеней: волостной, окружной (уездной) и губернской
  • допустить к выборам всех собственников земли, в том числе государственных крестьян (45% от общего числа)

Выборность Госдумы впервые предполагалась как основанная на избирательном праве – многоступенчатом, неравном для дворян и крестьян, но широком. Реформа М. Сперанского не наделяла Госдуму широкими полномочиями: все проекты обсуждались, одобренные думой, они вступали бы в силу только после царского на то разрешения.

Царь и правительство, как власть исполнительная, лишались права издавать законы по одному своему желанию.

Оценка реформ М. Сперанского.

Если бы проект государственной реформы России М. Сперанского был воплощен в действии, то сделал бы нашу страну конституционной монархией, а не абсолютной.

Реформа содержала много либеральных начал, но её основным недостатком был факт административного преобразования через отсутствие социального изменения. Чтобы стать либеральной, стране требовалось бы освободить крестьян от зависимости. Н М. Сперанский планировал изменять конституционное устройство государства, не освобождая 55% крестьянства от крепостного гнета.

Проект нового русского Гражданского уложения.

Этим проектом М. Сперанский занимался так же, как и первым: не беря во внимание реальную ситуацию в государстве.

Деятель составлял новые законы, основываясь на философских трудах Запада, на практике же многие эти принципы просто не работали.

Многие статьи этого проекта – калька Наполеоновского Кодекса, что вызвало возмущение в русском обществе.

М. Сперанский издал указ об изменении правил присвоения чинов, пытался бороться с дефицитом бюджета, который опустошали войны, участвовал в разработке таможенного тарифа в 1810 году.

Конец реформ.

Оппозиция реформатору и в верхах, и в низах продиктовала Александру I решение отстранить М. Сперанского от всех занимаемых должностей и сослать в Пермь. Так в марте 1812 года его политическая деятельность прервалась.

В 1819 г. М. Сперанского назначили генерал-губернатором Сибири, а в 1821 г. он вернулся в Петербург, стал членом учреждённого Государственного совета. После вынужденной ссылки М. Сперанский пересмотрел взгляды, стал высказывать мысли, противоположные прежним.

Похожие статьи

Государственные реформы М. М. Сперанского и А. А. Аракчеева

Процесс проведения государственных реформ в России, который начался в начале 18 века был прерван после вступления страны в войну с Францией в 1805- 1807 гг. Эта война закончилась Тильзитским миром, невыгодным для России, из-за чего престиж императора был подорван. Поэтому, чтобы восстановить свой авторитет, император Александр I решил продолжить начатые  реформы по совершенствованию государственного устройства.

Разработка реформ была предложена заместителю министра юстиции М. М. Сперанскому.

Суть реформ М.М. Сперанского

Сперанский был хорошим и исполнительным государственным служащим, отличался выдающимися способностями и трудолюбием, сам пробился в высшие слои российской бюрократии.

В 1809 г. Сперанский представил проект коренных государственных изменений -  «Введение к Уложению государственных законов». 

Целью реформы являлись два главных положения:

  • замена самодержавного правления конституционным;
  • отмена  крепостного права. 

В предложенном Сперанским проекте реформ отражались буржуазно-либеральные принципы: 

  • разделение властей на законодательную, исполнительную и судебную;
  •  народное представительство;
  •  выборное начало. 

Согласно проекту, Государственная дума должна быть высшим законодательным органом, Сенат - судебным органом, а Комитет министров - исполнительным органом.

Из проекта реформ Сперанского следовало следующее:

  1. Государственная дума должна была выражать «мнение народа», однако инициатива принятия новых законов оставалась в руках императора и его бюрократии.
  2. Император сохранял за собой политические и административные полномочия.
  3. Дворянам и среднему сословию (купцам, мещанам, государственным крестьянам, имевшим недвижимость) должны предоставляться избирательные права.
  4. Обозначились гражданские права. Например,  никто не мог быть наказан без судебного приговора. 
  5. Предлагалось создать Государственный совет для  рассмотрения законов и координации деятельности высших государственных учреждений.

Предоставленный проект реформ император одобрил, назвав его «удовлетворительным и полезным». Но приближенные императора выступили против проекта, увидев в нем «посягательство на священные основы российской государственности».

Из предложенных Сперанским реформ были одобрены и реализованы лишь те, которые  касались создания Государственного совета и завершения министерской реформы. 

В 1810 г. был создан высший законосовещательный орган - Государственный совет. Основной задачей нового органа стало приведение правовой системы к общему единообразию. Государственный секретарь руководил канцелярией Государственного совета и занимался всем текущим делопроизводством.
Первым государственным секретарем был назначен М. М. Сперанский.  

Нужна помощь преподавателя?

Опиши задание — и наши эксперты тебе помогут!

Описать задание

В 1811 году Сперанский ввел новый законопроект -  «Общее учреждение министерств», который завершал министерскую реформу. Согласно законопроекту, численность министров увеличилась до 12 человек, разделялись их пределы ответственности, определялась структура и т.п.

В 1809 г. произошло издательство  «Указа о придворных званиях». Данный указ определял следующее:

  1. Служба при дворе не имеет никаких привилегий.
  2. Те, кто имеет  придворные звания, должны поступать на воинскую службу или гражданскую. 
  3. Чиновники обязаны  иметь соответствующее образование, обязательно знать базовые дисциплины: право, историю, иностранный язык, статистику, математику.

Так, у М. М. Сперанского появилось множество врагов, назвавших его преобразования преступными. Поэтому М. М. Сперанский вынужден был уйти в отставку в  марте 1812 г.  Он был отстранен от государственного управления вплоть до 1816 года и сослан в Пермь.

В 1816 г.  его вернули на государственную службу и присвоили звание губернатора Пензы, в 1819 году он стал генерал-губернатором Сибири. 

В 1821 году император пригласил М. М. Сперанского в Петербург, указав, что его отставка была «вынужденный жертвой», на которую ему пришлось пойти, чтобы снизить рост недовольства среди большинства дворян, противившихся любым переменам.

Важно отметить, что при Александре I были предприняты попытки следующих реформ:

  1. 1815 г. - введении конституции в Царстве Польском.
  2. 1809 г.- в результате присоединения Финляндии к России император сохранил сейм и конституционное устройство Финляндии.
  3. 1819 - 1820 гг.- создание Н. Н. Новосильцевым «Уставной грамоты Российской империи». Согласно грамоте власть делилась на законодательную, исполнительную и судебную, вводился принцип равенства граждан перед законом и федеративный принцип государственного управления. Важно отметить, что данный проект принят не был и остался только на бумаге.
  4. 1808— 1810 гг.- реформы А.А. Аракчеева.

Основные положения реформ А.А. Аракчеева

А.А. Аракчеев был военным министром, пользовавшимся доверием  у Александра I. В 1808 году он начал проведение реформ в армии. А.А. Аракчеев характеризовали как честного и преданного военного, который отличался беспощадностью в своей исполнительской деятельности (его девизом был следующий: «Без лести предан»).

Аракчеев провел следующие реформы:

  • реформирование артиллерии;
  • порядок в армейском хозяйстве;
  • сделал вооруженные силы мобильными.

После войны с Наполеоном в 1812 году, влияние Аракчеева на императора значительно усилилось. Он подчинил себе Госсовет, Комитет министров, Собственную Его Императорского Величества канцелярию.

Именно с деятельностью Аракчеева связан ряд серьезных преобразований, в том числе крестьянская реформа (1816—1819 гг.) Реформа была проведена в Прибалтике и отображалась в двух законопроектах - «Положении об эстляндских крестьянах» и «Положении о лифляндских крестьянах».

Согласно реформе крестьяне получали личную свободу, однако без земли, т.к. земля признавалась помещичьей собственностью. Так же крестьянам предоставлялось право владения землей на условиях аренды с последующей возможностью выкупа. Когда Аракчеев составлял проект этой реформы, он руководствовался указом императора 
 «не стеснять помещиков, не применять к ним насильственных мер».

Реформистская деятельность М. Сперанского: идеи и результаты

Вступление на престол молодого императора Александра I совпало с необходимостью кардинальных перемен во многих сферах русской жизни. Молодой император, получивший прекрасное европейское образование, задумал реформировать российскую систему образования. Разработка коренных изменений в сфере образования была поручена М. М. Сперанскому, достойно проявившему себя в преобразовании страны. Реформистская деятельность М.Сперанский показал возможность преобразования империи в современное государство. И не его вина, что многие замечательные проекты остались на бумаге.

краткая биография

Сперанский Михаил Михайлович родился в семье бедного сельского священнослужителя. Получив хорошее домашнее образование, Сперанский решил продолжить дело отца и поступил в Петербургское духовное училище. После окончания этого учебного заведения Сперанский некоторое время работал учителем.Позже ему посчастливилось занять пост личного секретаря князя Куракина, который был одним из ближайших друзей Павла. Вскоре после вступления на престол Александра I Куракин получил должность генерального прокурора при Сенате. Не забывайте князя и его секретаря - Сперанский находился в одном положении с государственным чиновником.

Необычайный интеллект и прекрасные организаторские способности сделали бывшего учителя практически незаменимым в Сенате. Так реформистская деятельность М.Сперанский начал.

Политическая реформа

Работу в Секретном комитете подготовил М. Сперанского работать над внедрением политических и социальных преобразований в стране. В 1803 году Михаил Михайлович изложил свое видение судебной системы отдельным документом. «Записка об организации государственных и судебных учреждений в России» сводилась к постепенному ограничению самодержавия, превращению России в конституционную монархию, усилению роли среднего класса.Так, чиновник предложил учесть опасность повторения «французского безумия» в России - то есть французской революции. Предотвратить повторение властных сценариев в России и смягчить самодержавие в стране - это была реформистская деятельность М. М. Сперанского.

Кратко о главном

В политических преобразованиях реформаторская деятельность М.М. Сперанского сводилась к нескольким пунктам, которые позволили бы стране стать правовым государством.

Александр I в целом одобрил "Записку"... ». Созданная им комиссия приступила к разработке детального плана новых преобразований, что явилось началом реформаторской деятельности М.М. Сперанского. Идеи первоначального проекта неоднократно подвергались критике и обсуждению.

План реформ

Генплан был принят. составлен в 1809 г., и его основные тезисы были следующие:

1. Три ветви государственной власти должны управлять Российской империей: законодательная власть должна находиться в руках вновь созданного выборного учреждения; рычаги исполнительной власти принадлежат соответствующие министерства, а судебная власть находится в руках Сената.

2. Реформистская деятельность М. Сперанского положила начало существованию еще одной власти. Он должен был называться Консультативный совет. Новое учреждение должно было находиться вне ветвей власти. Должностные лица этого учреждения должны рассматривать различные законопроекты, учитывать их обоснованность и целесообразность. Если Консультативный совет за окончательное решение, оно будет вынесено в Думу.

3. Реформаторская деятельность М. Сперанского была направлена ​​на разделение всех жителей Российской империи на три больших сословия - дворянство, так называемый средний класс и трудящиеся.

4. Управлять страной могли только представители высшего и среднего классов. Имущественные классы получили право голоса, чтобы быть избранными в различные государственные органы. Трудящимся были предоставлены только общие гражданские права. Но, по мере накопления личной собственности у крестьян и рабочих появилась возможность перейти в имущественные классы - сначала в купечество, а затем, возможно, и в дворянство.

5. Законодательную власть в стране представляла Дума.Реформистская деятельность Сперанского М.М. послужила основой для появления нового избирательного механизма. Депутатов предлагалось выбрать в четыре этапа: сначала избирались представители волостей, затем определялся состав районной Думы. На третьем этапе были проведены выборы в законодательный совет провинции. И только депутаты областных советов имели право участвовать в выборах в Государственную Думу. Назначенный царем канцлер должен был руководить работой Государственной думы.

В этих кратких тезисах показаны основные результаты кропотливой работы, которую воплотила в жизнь реформаторская деятельность М. Сперанского. Резюме его записки превратилось в многолетний поэтапный план превращения страны в современную державу.

План действий

Опасаясь революционных движений, царь Александр решил реализовать озвученный план поэтапно, чтобы не вызвать серьезных катаклизмов в российском обществе. Работу по совершенствованию государственной машины предлагалось вести несколько десятилетий.Конечным результатом должна была стать отмена крепостного права и превращение России в конституционную монархию.

Провозглашение Манифеста о создании нового органа власти, Государственного совета, стало первым шагом на пути преобразований, который был проложен реформистской деятельностью М. М. Сперанского. Краткое содержание Манифеста сводилось к следующему:

  • все проекты, направленные на принятие новых законов, должны рассматриваться представителями Госсовета;
  • Совет оценил содержание и рациональность новых законов, оценил возможность их принятия и реализации;
  • членов Госсовета должны были участвовать в работе профильных министерств и вносить предложения по рациональному использованию средств.

Завершение реформ

В 1811 г. реформистская деятельность М. Сперанский привел к появлению проекта Кодекса Правительственного Сената. Этот пакет документов должен был стать следующим этапом политических реформ в стране. Разделение ветвей власти предполагало, что весь Сенат будет разделен на правительственную и судебную ветви. Но этой трансформации не было позволено произойти. Желание предоставить крестьянам такие же гражданские права, как и остальной народ, вызвало в стране такую ​​бурю негодования, что царь был вынужден свернуть проект реформ и отправить Сперанского в отставку.Его отправили в поселок в Перми, где он прожил всю оставшуюся жизнь на скромную пенсию бывшего чиновника.

Итоги

По поручению царя Сперанского М.М. Разработал проекты финансово-экономической трансформации. Они предусматривали ограничение расходов казны и повышение налогов для дворян. Подобные проекты вызывали резкую критику в обществе, многие известные мыслители того времени высказывались против Сперанского. Сперанского даже подозревали в антироссийской деятельности, и на фоне усиления Наполеона во Франции подобные подозрения могли иметь очень серьезные последствия.

Опасаясь открытого возмущения, Александр отправляет Сперанского в отставку.

Значение реформ

Невозможно отрицать значимость проектов, давших начало реформаторской деятельности М. М. Сперанского. Результаты работы этого реформатора стали основой кардинальных изменений в структуре российского общества середины XIX века.

биография, годы жизни, деятельность, фото

.

Известный чиновник и реформатор Михаил Сперанский (годы жизни: 1772-1839) известен как автор нескольких программ по изменению российского законодательства в начале 19 века.Он пережил пик и закат своей карьеры, не все его идеи были реализованы, но именно его имя является синонимом либерального направления, в котором могло развиваться наше государство при Александре I и Николае I.

Детство

Будущее крупный государственный деятель Михаил Сперанский родился 1 января 1772 года во Владимирской губернии. Отцовство у него было скромное - отец работал в церкви, а мать приходилась дочерью дьякону. Именно родители больше всего повлияли на характер и интересы ребенка.Он быстро научился читать и много читать. Большое влияние на Мишу оказал его дед, который много ходил в церковь, а также познакомил внука с такими важными книгами, как «Часы» и «Апостол».

Даже после своего восхождения Михаил Сперанский не забыл о своем происхождении. Будучи государственным секретарем, он убирал свои комнаты и, как правило, вел скромный образ жизни и привычки.

Михаил начал систематическое обучение в 1780 году в стенах Владимирской епархиальной семинарии.Именно там, благодаря незаурядным способностям, мальчика впервые записали под фамилией Сперанский, которая представляла собой кальку от латинского прилагательного, переводимого как «дающий надежду». Отцом ребенка был Васильев. Михаил Сперанский сразу выделился из общей массы учеников своим остроумием, желанием учиться, любовью к чтению, а также скромным, но твердым характером. Семинария позволила ему выучить латинский и греческий языки.

Переезд в Санкт-Петербург

Михаил мог остаться во Владимире и начать духовную карьеру.Он даже стал сокамерником местного игумена. Но уже в 1788 году Сперанский как один из самых ярких и талантливых учеников получил возможность поехать в Петербург и продолжить обучение в Александро-Невской духовной семинарии. Это учреждение находилось под прямым контролем Синода. Здесь разрабатывались новые программы и преподавали лучшие учителя.

На новом месте Сперанский Михаил Михайлович изучал не только богословие, но и светские дисциплины, в том числе высшую математику, физику, философию и французский язык, который в то время был международным.В семинарии царила строгая дисциплина, благодаря которой студенты вырабатывали навыки многочасовой напряженной умственной работы. После того, как Сперанский научился читать по-французски, он увлекся трудами ученых этой страны. Доступ к лучшим и новейшим книгам сделал молодого семинариста одним из самых образованных людей в стране.

В 1792 году Сперанский Михаил Михайлович окончил свое обучение. Он остался в семинарии, где несколько лет был учителем математики, философии и красноречия.В свободное время увлекался художественной литературой, а также писал стихи. Некоторые из них были опубликованы в петербургских журналах. Вся деятельность учителя семинарии дала ему многогранную личность с широчайшим кругозором.

Начало государственной службы

В 1795 году молодого Сперанского по рекомендации митрополита Гавриила взял на работу Александр Куракин. Он был видным столичным чиновником и дипломатом. С вступлением на престол Павла I он был назначен генеральным прокурором.Куракину нужен был секретарь, способный справиться с большим объемом работы. Именно таким человеком был Михаил Михайлович Сперанский. Короче говоря, он предпочел светскую карьеру карьере в церкви. При этом они не хотели расставаться с талантливым учителем в семинарии. Митрополит пригласил его принять монашеский постриг, после чего Сперанский мог рассчитывать на сан епископа. Однако он отказался и в 1797 году получил чин титулярного советника в канцелярии генерального прокурора.

Очень быстро чиновник поднялся по карьерной лестнице. Всего через пару лет он стал статским советником. Биография Сперанского Михаила Михайловича - это история стремительного продвижения по службе благодаря уникальному трудолюбию и таланту. Эти качества позволили ему не заискивать перед начальством, что послужило причиной его непререкаемого авторитета в будущем. Действительно, Сперанский работал в первую очередь на благо государства, а уже потом думал о собственных интересах.

Возвышение реформатора

В 1801 году новым императором России стал Александр I.Он радикально отличался от своего деспотичного отца Пола, который был известен военными манерами и консервативными взглядами. Новый монарх был либералом и хотел произвести в своей стране все те реформы, которые были необходимы для нормального развития государства. В целом они должны были расширить свободы населения.

Такого же мнения придерживался и Михаил Сперанский. Биография этого деятеля чрезвычайно любопытна: он познакомился с Александром I, когда тот был еще наследником престола, а чиновник занимался обустройством Петербурга, будучи статским советником.Молодые люди сразу нашли общий язык, и будущий царь не забыл образ яркого уроженца Владимирской губернии. С вступлением на престол Александр I назначил Сперанского статс-секретарем при Дмитрии Трощинском. Этот человек был сенатором и одним из доверенных лиц нового императора.

Вскоре деятельность Михаила Сперанского привлекла внимание членов Секретного комитета. Это были самые близкие к Александру государственные деятели, объединенные в один круг для выработки решений неотложных реформ.Сперанский стал помощником знаменитого Виктора Кочубея.

В секретном комитете

Уже в 1802 году благодаря Секретному комитету Александр I учредил министерства. Они заменили устаревшие и малоэффективные училища петровской эпохи. Кочубей стал первым министром внутренних дел, а Сперанский стал его статс-секретарем. Он был идеальным клерком: работал с бумагами по десяткам часов в день. Вскоре Михаил Михайлович начал писать свои записки высшим людям, в которых излагал свои взгляды на проекты различных реформ.

Здесь не лишним будет еще раз упомянуть, что взгляды Сперанского сформировались при чтении французских мыслителей XVIII века: Вольтера и др. Либеральные идеи госсекретаря нашли отклик у власти. Вскоре его назначили начальником отдела, занимавшегося разработкой проектов реформ.

Именно под руководством Михаила Михайловича были сформулированы основные положения знаменитого «Указа о вольном земледелии». Это был первый робкий шаг правительства России на пути к отмене крепостного права.Согласно указу, дворяне теперь могли отпускать крестьян с землей. Несмотря на то, что эта инициатива нашла очень небольшой отклик в привилегированном классе, Александр остался доволен проделанной работой. Он поручил приступить к разработке плана радикальных реформ в стране. Во главе этого процесса стоял Сперанский Михаил Михайлович. Краткая биография этого государственного деятеля поражает воображение: он, не имея связей, только благодаря собственным способностям и трудолюбию смог добраться до вершины политического Олимпа России.

В период с 1803 по 1806 гг. Сперанский стал автором большого количества записок, доставленных императору. В своих бумагах статс-секретарь проанализировал текущее состояние судебной и исполнительной власти. Основным предложением Михаила Михайловича было изменение государственного строя. Согласно его записям, Россия должна была стать конституционной монархией, в которой император был лишен абсолютной власти. Эти проекты остались нереализованными, но Александр одобрил многие тезисы Сперанского.Благодаря своей колоссальной работе, этот чиновник также полностью изменил язык церковного общения в государственных структурах. Он отказался от многочисленных архаизмов XIX века, а его мысли на бумаге, лишенные ненужности, были ясны и максимально ясны.

Помощник императора

В 1806 году Александр I сделал бывшего семинариста своим главным помощником, «забрав» его у Кочубея. Императору был нужен именно такой человек, как Михаил Михайлович Сперанский. Краткая биография этого госслужащего не обходится без описания его взаимоотношений с монархом.Александр ценил Сперанского прежде всего за его оторванность от различных аристократических кругов, каждый из которых лоббировал свои интересы. На этот раз незнакомое происхождение Михаила сыграло ему на руку. Он начал получать приказы лично от короля.

В этом статусе Сперанский занялся обучением в духовных семинариях - лично ему близкой темы. Он стал автором устава, регулирующего всю деятельность этих учреждений. Эти правила благополучно просуществовали до 1917 года. Еще одно важное начинание Сперанского как ревизора русского образования - это составление записки, в которой он изложил принципы работы будущего Царскосельского лицея.В этом заведении на протяжении нескольких поколений учили цвету нации - самой молодой из самых почтенных аристократических семей. Его выпускником был Александр Пушкин.

Дипломатическая служба

В то же время Александр I был очень занят внешней политикой. Отправляясь в Европу, он неизменно брал с собой Сперанского. Так было в 1807 году, когда при Наполеоне состоялся Эрфуртский конгресс. Именно тогда Европа впервые узнала, кто такой Михаил Сперанский. Краткая биография этого чиновника обязательно упоминает его навыки полиглота.Но до 1807 года он ни разу не был за границей.

Теперь благодаря знанию языков Сперанский смог приятно удивить все иностранные делегации, присутствовавшие в Эрфурте. Сам Наполеон обратил внимание на помощника Александра и даже якобы в шутку попросил российского императора сменить талантливого статс-секретаря «на какое-то царство». Но за границей Сперанский также отметил практическую пользу собственного пребывания в составе делегации. Он принял участие в обсуждении и заключении мира между Францией и Россией.Однако политическая ситуация в Европе тогда была шаткой, и вскоре эти договоренности были забыты.

Зенит карьера

Сперанский много времени работал над составлением требований для приема на госслужбу. Знания многих чиновников не соответствовали уровню занимаемой ими должности. Причиной такой ситуации стала широко распространенная практика изготовления устройства для обслуживания благодаря семейным связям. Поэтому Сперанский предложил ввести экзамены для людей, которые хотят стать чиновниками.Александр согласился с этой идеей, и вскоре эти нормы стали законом.

С присоединением Финляндии к России Сперанский начал проводить реформы в новой губернии. Не было консервативной знати, поэтому именно в этой стране Александр смог реализовать свои самые смелые либеральные идеи. В 1810 г. был учрежден Государственный совет. Также появилась должность госсекретаря, которой стал Сперанский Михаил Михайлович. Деятельность реформатора не прошла даром. Теперь он официально стал вторым человеком в штате.

Опал

Многочисленные реформы Сперанского затронули практически все сферы жизни в стране. Где-то изменения были радикальными, чему сопротивлялась застойная часть общества. Михаил Михайлович не любил дворянство, потому что из-за его деятельности в первую очередь пострадали именно их интересы. К 1812 году при дворе императора появилась группа министров и доверенных лиц, которые начали интриги против Сперанского. О нем распускали ложные слухи, например, что он якобы критиковал императора.С приближением войны многие недоброжелатели стали вспоминать его связь с Наполеоном в Эрфурте.

В марте 1812 года Михаил Сперанский был снят со всех занимаемых должностей. Ему было приказано покинуть столицу. Фактически он был в ссылке: сначала в Нижнем Новгороде, затем в Новгородской губернии. Спустя несколько лет ему все же удалось удалить опалы.

В 1816 году он был назначен Пензаговернатором. Михаил Сперанский, вкратце, плохо знал этот регион. Тем не менее, благодаря своим организаторским способностям он смог стать гарантом порядка в провинции.Местное население полюбило бывшего госсекретаря.

После Пензы чиновник находился в Иркутске, где работал сибирским губернатором с 1819 по 1821 год. Здесь положение дел было еще более запущенным, чем в Пензе. Сперанский взялся за договоренность: он разработал положения об управлении национальными меньшинствами и ведении хозяйственной деятельности.

Снова в Петербурге

В 1821 году Михаил Михайлович впервые за много лет появился в Петербурге.Он устроил встречу с Александром I. Император дал понять, что старые времена, когда Сперанский был вторым человеком в государстве, остались позади. Тем не менее его назначили главой комиссии по разработке законопроектов. Это была именно та позиция, на которой можно было максимально применить весь опыт, которым обладал Михаил Сперанский. Исторический портрет этого человека показывает его как выдающегося реформатора. Поэтому он снова взялся за преображение.

Первым делом чиновник завершил сибирский бизнес.Согласно его записям, была проведена административная реформа. Сибирь делилась на Западную и Восточную. В последние годы своего правления Александр I много времени уделял устройству военных поселений. Сейчас ими занимается и Сперанский, который вместе с Алексеем Аракчеевым возглавил соответствующую комиссию.

При Николае I

В 1825 году умер Александр I. Произошло неудачное выступление декабристов. Сперанскому было поручено составить Манифест о начале правления Николая I.Новый правитель ценил заслуги Сперанского, несмотря на то, что у него были свои политические взгляды. Знаменитый чиновник оставался либералом. Царь был консерватором, и восстание декабристов еще более усилило его противодействие реформам.

В николаевские годы главным трудом Сперанского стало составление полного свода законов Российской Империи. Многотомное издание объединило огромное количество указов, первый из которых появился в 17 веке. В январе 1839 г., благодаря его заслугам, Сперанский получил титул графа.Однако 11 февраля он скончался в возрасте 67 лет.

Его энергичный и плодотворный труд стал локомотивом российских реформ первых лет правления Александра I. На пике своей карьеры Сперанский находился в незаслуженном состоянии. позор, но позже вернулся к своим обязанностям. Он верно служил государству, несмотря на все невзгоды.

p>

самолетов и результатов. Реформатская деятельность М. Сперанский тест реформирования деятельности Сперанский

Вступление на престол молодого императора Александра I совпало с необходимостью кардинальных преобразований во многих сферах жизни России.Молодой император, получивший прекрасное европейское образование, поставил цель реформировать российскую систему обучения. Развитие коренного изменения в области просвещения было поручено М. М. Сперанскому, достойно проявившему себя в обращении страны. Реформаторская деятельность Сперанского М. М. показала возможность преобразования империи в современное государство. И не его вина, что на бумаге осталось много замечательных проектов.

краткая биография

Михайлович родился в семье бедного сельского священнослужителя.Получив хорошее домашнее образование, Сперанский решил продолжить дело Отца и поступил в Петербургское Духовное Училище. После окончания учебного заведения Сперанский некоторое время работал учителем. Позже ему посчастливилось занять должность личного секретаря князя Куракина, который был одним из ближайших друзей Павла I. Вскоре после вступления на престол Александра I Куракин получает должность прокурора при Сенате. Не забыл князь и о его секретаре - Сперанский получил должность государственного чиновника.

Выдающийся ум и прекрасные организаторские способности сделали бывшего учителя практически незаменимым человеком в Сенате. Так началась реформированная деятельность Сперанского М. М.

Политическая реформа

Работа подготовила М. М. Сперанского к работе по внедрению политических и социальных преобразований в стране. В 1803 году Михаил Михайлович изложил свое видение судебной системы отдельным документом. «Записка об устройстве государственных и судебных институтов в России» сводилась к постепенному ограничению самодержавия, превращению России в конституционную монархию, усилению роли среднего класса.Так, чиновник предложил учесть опасность повторения в России «французского безумия» - французской революции. Предотвратить повторение властных сценариев в России и смягчить самодержавие в стране - это была реформистская деятельность М. М. Сперанского.

Коротко о главном

Реформистская деятельность М. М. Сперанского в ходе политических преобразований сводилась к нескольким пунктам, которые позволили бы стране стать правовым государством.

В целом одобрено "примечание... ». Созданная им комиссия приступила к разработке детального плана новых преобразований, положивших начало реформаторской деятельности М.М. Сперанского. Намерения первоначального проекта неоднократно подвергались критике и обсуждению.

План реформ

Генеральный План был составлен в 1809 году, и его основные положения были следующими:

1. Для управления Российской Империей три ветви государства должны находиться в руках вновь созданного избирательного института; исполнительные рычаги принадлежат профильным министерствам. , а судебная власть находится в руках Сената.

2. Реформаторская деятельность Сперанского М. М. положила начало существованию другой власти. Его предполагалось называть Исполнительным советом. Новое учреждение должно было находиться вне ветвей власти. Должностные лица этого учреждения должны рассматривать различные законопроекты, учитывать их интеллект и целесообразность. Если за экспертный совет - окончательное решение принимается в Думе.

3. Реформаторская деятельность М. М. Сперанского была направлена ​​на раскол всех жителей Российской Империи на три крупных сословия - дворянство, так называемый средний класс и рабочий человек.

4. Управлять страной могли только представители высших и средних классов. Имущественные классы получили право голоса, выборов в различные органы власти. Рабочим были предоставлены только общие гражданские права. Но по мере накопления личной собственности у крестьян и рабочих появилась возможность перейти в имущественные классы - сначала в купечество, а затем, возможно, в дворянство.

5. Законодательную власть в стране представляла Дума. Реформаторская деятельность Сперанского М.М. послужил основой для появления нового избирательного механизма. Депутатам было предложено выбрать четыре ступени: сначала выбирались волостные представители, затем определялся состав окружного ДУМа. На третьем этапе прошли выборы в Законодательный совет провинций. И только депутаты губернской думы имели право участвовать в руководящей работе Государственной думы, которая должна была быть назначена королем канцлером.

В этих кратких тезисах показаны основные результаты кропотливой работы, которой реформистская деятельность М.М. Сперанский пробудился к жизни. Резюме Его записки переросли в долгосрочный, разработанный поэтапный план по превращению страны в современную державу.

План действий

Опасаясь революционных движений, царь Александр I решил поэтапно выполнить озвученный план, чтобы не вызвать сильных катаклизмов в российском обществе. Работы по усовершенствованию состояния автомобиля предлагались на несколько десятилетий. Конечным результатом должна была стать отмена крепостного права и превращение России в конституционную монархию.

Обнародование манифеста о создании нового органа государственной власти - Госсовета - стало первым шагом на пути преобразований, которыми М. М. Сперансский проложил реформу. Краткое содержание манифеста сводилось к следующему:

  • все проекты, направленные на принятие новых законов, должны рассматриваться представителями Госсовета;
  • Совет оценил содержание и рациональность новых законов, оценил возможность их принятия и реализации;
  • членов Госсовета должны были участвовать в работе профильных министерств и вносить предложения по рациональному использованию средств.

Свертывание реформ

В 1811 году реформаторская деятельность Сперанского М.М. привела к появлению проекта низложения. Этот пакет документов должен был стать следующим этапом политических преобразований в стране. Разделение ветвей власти предполагало, что весь Сенат разделен на правящую и судебную ветви. Но этому преобразованию не дано было произойти. Стремление предоставить крестьянам такие же гражданские права, как и остальной народ, вызвало такую ​​бурю негодования в стране, что царь был вынужден свести к минимуму призывные преобразования и отправить Сперанского в отставку.Его отправили в поселок в Пермь, где он прожил остаток жизни на скромную пенсию бывшего чиновника.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По поручению короля Сперанский М.М. Разработал проекты финансово-экономических преобразований. Они предусматривали ограничение расходов казны и повышение налогов для дворян. Подобные проекты вызывали резкую критику в обществе, многие известные мыслители того времени выступали против Сперанского. Сперанского даже подозревали в антироссийской деятельности, и на фоне усиления Наполеона во Франции подобные подозрения могли иметь очень глубокие последствия.

Опасаясь открытого возмущения, Александр отправляет Сперанского на пенсию.

Значение реформ

Невозможно отрицать важность проектов, положивших начало реформистской деятельности М. М. Сперанского. Результаты этого реформатора стали основой коренных изменений в структуре российского общества в середине XIX века.

Соглашение об использовании материалов сайта

Пожалуйста, используйте опубликованные на сайте работы исключительно в личных целях.Публикация материалов на других сайтах запрещена.
Это (и все другие) произведение доступно для скачивания совершенно бесплатно. Мысленно могу поблагодарить ее автора и коллектив коллектива.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в учебе и работе, будут Вам очень благодарны.

Похожие документы

    Биография Сперанский Михаил Михайлович.Первый проект политической трансформации. Вопрос о необходимости осторожного введения в стране конституционной монархии. Введение в депонирование государственных законов. Реализация реформ Сперанского на практике.

    курсовая, добавлен 23.10.2012

    Политическая ситуация в России в первой половине XIX века. Личность Александра I, его реформы. Биография М. Сперанский, его назначение на пост помощника царя, планы и некоторые осуществленные реформы, а также дальнейшая деятельность в ссылке.

    аннотация, добавлен 27.10.2009

    Первые годы правления Александра I. Записка об устройстве судебных и государственных органов в России. Официальная карьера Сперанского и воплощение задуманного в жизнь. Основание трех основных поместий. Проект политической реформы и причины неудач.

    презентация, добавлен 11.11.2014

    краткая биография М.М. Сперанского. План центральной администрации, Государственного совета, учреждений министерств и сената.Реорганизация финансовой политики России. Освобождение от государственных дел и восстановление Сперанского на службе.

    экспертиза, добавлен 23.02.2012

    Определение факторов, повлиявших на укрепление государственного аппарата и проведение ряда реформ в начале XIX в. в. Исторические условия формирования мировоззрения М.М. Сперанский. Деятельность М.М. Сперанский в царствование Александра I и Николая I.

    аннотация, добавлен 29.04.2019

    Учение Михаила Михайловича Сперанского о праве и государстве.Анализ его государственно-правовых взглядов на общие и частные вопросы. контролируемые государством, права и законодательство, финансы, политические и гражданские свободы, диссертация.

    экзамен, добавлен 05.05.2016

    Биография графа Михаила Михайловича Сперанского - общественного и государственного деятеля Времена Александра I и Николая I, реформатора, законодателя, основоположника российской юридической науки и теоретического права. Политические взгляды и реформы.

    презентация, добавлен 15.01.2015

▫ Мнение - имеет.Выразить гадость - тоже получается. Увы. А потом: если этот актер не выразил (я не знаю, с какой гибелью и на какую срочную ... накал? Так наебали учения? Другое?) Это оскорбительно? Это не с айфона идти куда снимать! И не танцуй под песню. Глупая, правда, песня. Вот идет с айфоном и под песню когда - это настоящее оскорбление! Сайт школы распадается с записью заслуженных - заслуженных эпитетов ... = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = А еще есть понятие 'Честь' И 'Совесть'.Наряду с понятием «Да, я хотел поставить!» К сожалению. ... Коллеги этого `докладчика` прокомментировали. Я уже даю свой комментарий - к их комментарию: - Епископ Стефан призвал «спокойно относиться к высказываниям главы Белгородской епархии и не рассматривать их» в контексте того, что владыка Иоанн кого-то осуждает или что-то вводит в религиозное понимание события, какие есть новшества`. = = = = = = = = = = = = = = = = = = ИТишкин ты кот, но! Любит! И никаких `что-то в этом роде`, а... И дурачиться, что он приносит. И это в религиозном - да! - понимание событий. Но вы, мол, спокойно себя чувствуете. Не считайте. Ибо сказал этот скатл, хотя и так, но теперь так не бывает! (Почему? И поэтому! Но как так ... а так!). ... расслабься, вроде. Ешьте попкорн. Спокойно, граждане, что за волнение. = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = u003d = u003 = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003d = u003 = Ладно, хоть я и не говорила, что тут подтянусь, рты, шипение, промелькнули! `... - Есть ли совесть ?! Позор - Есть ?!
▫ Пушкин, так Радищева чихнула, особенно по слогу и содержанию, которое после его залежей Радищева страшно даже открыть. Так что министр ереси не читал, ну и тут немного ошибся. Но в целом я получил право. Его не вызвали аудитором. 🙂 🙂 Но почему она не сказала, что школы сами выбирают программы, ведь сейчас важны универсальные знания, целостное понимание, бла-бла ... Ведь это может быть «заказ» конкурентов.... и время Эфира ограничено, она могла бесконечно `уходить из темы`. Она ступила в то .. Вот так как-то его про СНИЛС спросили у какого-то министра, поставила такой подъем, согласилась, что это не Православие против того, что с трибун выступал вовсе не Патриарх 2013, а какие-то православные и секты против сноба, а за православие .... и ничего не изменилось ....
▫ Каждый имеет право на свое мнение! Моему родному дяде было 18 лет, он крестился. А два брата-бабушки умерли в 20-24 года, оба крестились... Статистики нет и быть не может - сколько крестилось, а сколько нет ... Но это не вызывает здесь никакой чести. Низкое образование, к сожалению, на сайте школы смотрит ... Эх, учителя!

1. Александр 1Мератор был

1) внук Екатерины 2 и брат Павел 1

2) племянник Екатерины 2 и сын Павла 1

3) внук Екатерины 2 и сын Павла 1

4) Племянник Екатерины 2 и брат Павел 1

2.В состав неправомерной комиссии не вошел

1) Строган П.А.

2) В.П. Кочубай

3) Новосильцев Н.Н.

4) Сенавин Д.Н.

3. Б. Новой системы образования 1803 г., созданной по указу Александра 1, не было

1) Гимназия

2) приходские школы

3) университеты

4) сельские школы

4. Принято постановление о «бесплатных лезвиях»

5.Четвертая антифранцовая коалиция была создана

1) в 1804 году после разгрома «континентальной блокады» Наполеона

2) в 1805 году после заключения тильзитского мира

3) в 1806 году после победы Наполеона при Аустерлице

4) в 1807 году после войны со Швецией

6. реформирует M.M. Сперанский получил поддержку императора

4) в 1809 г. имущество путем выкупа

2) право их выкупа и право приобретения рабочих

3) право участвовать в земском управлении и ограниченная покупка земли

4) право выкупа себя и своих родственников в судебном порядке решение

8.Государственный совет был создан

2) осенью 1811 г. для подготовки выборов в Государственную Думу.

9. Согласно «Введение в законы штата о депозитах», были установлены три основные оценки:

    опция

1. Александр 1 стал императором России

1) в 1803 году после смерти брата

2) в 1801 году после смерти Екатерины 2

3) в 1803 году решить незаконную комиссию

4) в 1801 г. после убийства Павла 1 в результате дворцового переворота

2.К первому опубликованному Александру 1 ни одно постановление не применялось

1) об улучшении содержания пленных

2) о сокращении срока службы солдат регулярной армии

3) о свободе пропуска русских работ за границу

4) О передаче рассмотрения всех судебных дел в Сенат

3. Форма вышестоящих органов государственной власти Александр 1Предпал

1) введение министерств вместо коллегии и передача в Сенат высшей судебной власти

2) упразднение полномочий Сената и передача их незаконному комитету

3) Преобразование Сената в Высшую судебную власть и запрет на участие дворян в управлении городом

4 ) преобразование Сената в высшую судебную инстанцию ​​и упразднение рангов

4.Конвенция «О взаимной дружбе» была заключена

1) в 1801 году между Россией и Швецией

2) в 1804 году между Россией и Австрией

3) в 1801 году между Россией и Великобританией

4) в 1805 году между Россией и Швецией

5.Тильзитский мир был заключен

1) между Францией и Россией в 1807 г. эти страны стали союзниками

2) между Россией и Турцией на основе войны 1806-1812 гг.

3) между Россией и Швецией по итогам войны 1808-1809 гг.

4) между Россией и Ираном в 1813 году эти страны стали союзниками

6. Согласно «Введение в законы государства» были установлены три основные оценки:

1) дворянство, госслужащие, крепостные крестьяне

2) чиновники, помещики, крепостные крестьяне

3) дворянство, «среднее положение», «народные рабочие»

4) дворянство, «сетка и купцы», «каждый человек»

7.На голосование по проекту реформы 1809 г. поступило

1) только дворяне и матери

2) только лица, владевшие крестьянами-крепостями

3) все, кто имел движимое и недвижимое имущество

4) все, кто родился в России и прожил в ней не менее 10 лет

8. По задумке М.М. Сперанского, нужен был Сенат

1) разделенный на 8 министерств

2) разделенный на 3 пачки- судебные, государственные законы и министерские

3) разделены на 2 части

4) заменить Государственный совет

9.Постановление о «вольных клинках» было принято

1) в 1803 г. и разрешало помещикам продавать крепостных крестьян вместе с одним

2) в 1802 г. и разрешало крепостным крестьянам продавать излишки своей продукции на рынке

3) В 1803 г., и разрешил крепостным выкупать себя и свои деньги помещику

4) в 1802 г. и разрешил крестьянам крепости выкупать землю у помещика

Выступление Президента Халонен в Санкт-Петербурге 18 мая 2016 г.

Санкт-ПетербургПетербургский юридический форум
Выступление Президента Тарьи Халонен
Круглый стол, 18.5.2016

Ваши Превосходительства, дамы и господа,

Спасибо за вступительное слово. Очень приятно снова оказаться в Санкт-Петербурге. Большое спасибо организаторам круглого стола и Юридическому форуму за приглашение. В прошлом году я не смог принять участие в этом форуме, так как мне пришлось присутствовать на выпускной церемонии в Гарвардском университете, где я был приглашенным научным сотрудником весной 2015 года.

Последний раз я был в Санкт-Петербурге полтора года назад. В ходе этого визита особое внимание было уделено экологической стороне сотрудничества Финляндии и России. Мы живем в Балтийском море, мы обе арктические страны, и у нас протяженная общая сухопутная граница, поэтому есть много вопросов, особенно касающихся окружающей среды, с которыми нам нужно работать вместе.

Я коротко расскажу о прошлом, настоящем и будущем. Но позвольте мне начать с будущего.

Теперь у нас есть новая основа - Повестка дня в области устойчивого развития на период до 2030 года - в рамках которой мы можем работать как на двусторонней, так и на многосторонней основе по экологическим вопросам, а также по многим другим насущным проблемам, с которыми сталкиваются наши общества.Как хорошо известно, земной шар круглый, и отдельные страны в одиночку не могут решить все проблемы, которые пересекают границы и влияют на страны, находящиеся далеко друг от друга. Вот почему так важны цели в области устойчивого развития и Парижские климатические соглашения.

ЦУР представляют собой единое целое. Я называю это современной троицей: экономический рост приветствуется и даже необходим, но это должен быть существенный рост, который обеспечивает достойные рабочие места и создает богатство, которое распределяется более справедливым образом. Экономический рост также должен учитывать планетарные границы и здоровье нашей окружающей среды.

ЦУР касаются всех стран, и их успешная реализация требует участия гражданского общества и частного сектора в дополнение к правительствам и международным организациям. Одним из новых ключевых аспектов ЦУР - по сравнению с Целями развития тысячелетия - также является то, как они будут отслеживаться и измеряться с помощью показателей. Я твердо верю, что благодаря нашему пониманию развития сегодня, а также инструментов и ресурсов, которыми мы располагаем, мы сможем достичь более устойчивого, процветающего и справедливого будущего.

Дамы и господа,

Я хотел начать с упоминания ЦУР и Парижского соглашения по климату, потому что я считаю их очень важными также в свете сегодняшней дискуссии. Тема этой панели «Наследие Сперанского: актуальные вопросы законотворчества и кодификации» очень актуальна для нас не только тогда, когда мы обсуждаем национальные контексты, но и когда мы смотрим на то, как мир в глобальном масштабе пытается решать насущные проблемы. собравшись вместе, чтобы согласовать - и в некотором смысле систематизировать - передовой опыт, нормы и законы, чтобы сделать возможным развитие более устойчивых обществ.

Граф Михаил Сперанский был государственным деятелем, который, среди многих достижений, кодифицировал российское право и развил структуру российского управления. Он понимал, что полагаться только на добрую волю элит или тех, кто внедряет сложный неорганизованный правовой кодекс, недостаточно для обеспечения надлежащего управления и верховенства закона. Конкретные вопросы, с которыми он столкнулся, конечно, отличались от сегодняшних, но принципы, в которые он верил, по большей части устояли.

Меня много раз просили описать состояние нашего мира одним словом.Я бы сказал, что мы живем во времена неопределенности. Это чувство неуверенности везде обсуждается с людьми разного происхождения. Неопределенность, ощущаемая на глобальном или местном уровне, является результатом отсутствия доверия, плохого управления и беззакония среди других проблем, с которыми мы сталкиваемся. Я участвовал в работе Консультативного совета Доклада Всемирного банка о мировом развитии за 2017 год под названием «Управление и право», который занимается именно этим вопросом. Поздравляю с тем, что вы выбрали тему, которая так актуальна во всем мире.

ЦУР также определила управление и верховенство закона в качестве приоритетов, когда мы пытаемся построить более равноправные, справедливые и процветающие общества. На наследие Сперанского можно смотреть с восхищением. Однако, поскольку он был - именно - сыном своего времени, и хотя он восхищался французскими дискуссиями, он не считал роль представительных институтов и правительств такой же важной и уставной, как мы сегодня.

Так или иначе, он был прогрессивным реформатором своего времени в вопросах права и управления.Сегодня нам нужны глобальные правила для финансовых транзакций, а также выбросы углерода столько, сколько нам нужно, например, антикоррупционные и экологические законы в национальном масштабе - это в интересах всех. Современное общество более здоровое и процветающее, когда правовые системы ясны, а законы кодифицированы и применяются.

Уважаемые дамы и господа,

Теперь несколько слов о прошлом. Михаил Сперанский также является ключевой фигурой в истории Финляндии XIX века. Сперанский вырос из скромного происхождения и стал ближайшим советником Александра I.. Он был первым государственным секретарем Великого княжества Финляндского и ректором Императорского Александровского университета в Турку с 1809 по 1812 год. Он был человеком, через которого все дела, касающиеся Финляндии, представлялись царю, и он принимал в этом самое активное участие. разработка правил для того, что позже стало Императорским финским сенатом.

Сперанский лишился благосклонности царя в 1812 году и был депортирован в Сибирь, но позже вернулся на важные государственные должности при Николае I.На последнем этапе его карьеры его главным достижением стала кодификация российского права.

Можно сказать, что он оказал сильное влияние на позитивные настроения, которые окружали решения Александра I, когда Финляндия стала Великим княжеством Российским. Интересная деталь заключается в том, что в честь Сперанского в Эйре, Хельсинки, носила название улицы до 1928 года. 70 лет спустя, в 1998 году, ее восстановили.

Время автономии дало Финляндии время для создания собственной администрации и управления.Это было не всегда при легких обстоятельствах. Однако некоторые из глубоких шрамов были результатом не периода автономии, а, скорее, войн 20-го века. Случились войны, и нам нужно преодолеть разногласия. Войны не приносят мира. В современном мире чрезвычайно важно уважать закон и международное право. Если и когда происходит переход земли из-под контроля одного предприятия к другому, необходимо соблюдать закон.

Свобода выражения мнения - еще одна глобальная проблема.И это актуальный вопрос на севере, а также в Финляндии и Швеции, в этом году он посвящен 250-летию первого в мире Закона о свободе информации, который был опубликован в 1766 году, и его основателя Андерса Чидениуса . Это был большой шаг к свободе слова.

Если коротко вернуться к этому дню, всего две недели назад в Хельсинки отмечался Всемирный день свободы печати ЮНЕСКО. Финляндия седьмой год подряд занимает первое место в мире по свободе прессы.Не случайно Чидениус был из Финляндии.

Что ж, интересный поворот событий между Финляндией, Швецией и Россией произошел, когда положения Закона о свободе информации были ослаблены королем Густавом III и его преемником до того, как Швеция проиграла войну против России в 1809 году, а Финляндия стала автономным Великим государством. Герцогство. Ослабленный Закон оставался законом в Финляндии также под властью России. После проигранной войны в Швеции было проведено много прогрессивных реформ, но это уже не коснулось Финляндии.Однако у финнов было больше свобод, чем у русских.

Последние годы 19 века в России были неспокойными, и усилия Николая II запоздали. Затем полвека коммунистического государства принесли в Россию идеи, отличные от тех, что развивались в Финляндии и в целом на Западе.

Уважаемые дамы и господа,

Есть более короткие и более длинные циклы в экономике, но также в политике и развитии общества. Хорошее управление, демократия и закон в целом являются частью более длительного цикла, и именно поэтому Сперанский актуален.

Я остановлюсь на этом. Мне очень интересно услышать, что другие ораторы говорят о наследии Сперанского, и я с нетерпением жду продолжения дискуссии.

Спасибо.

Принц и принцесса Сарасоты - Новости - Sarasota Herald-Tribune

Она родилась в Белом доме. Он родился в семье русского дворянства. Их пути пересеклись и привели их в Сарасоту.

Каждый был рожден в поместье.

В случае Джулии Дент Грант, внучки героя Гражданской войны и действующего президента Улисса Гранта, поместье было не чем иным, как Белым домом, где она родилась 7 июня 1876 года, и ее дедушка обожал.

Ее будущий муж, князь Михаил Кантакузен, граф Сперанский, превзошел ее. Поместье этого лихого дворянина и солдата было одним из самых больших и богатых в Российской империи в то время, когда царский двор отвергал все, что могла предложить Европа. Согласно сообщениям, собственность принца занимала десятки тысяч акров и включала несколько поместий с фермами, лесами и роскошным замком. Его семья была одной из старейших в России. Он был известным всадником и игроком в поло, а также офицером кавалерийской гвардии, личного полка вдовствующей императрицы России.

Другая связь Джулии с аристократией Америки была через ее тетю, королеву чикагского общества Берту Палмер. Путешествуя с тётей по Европе, она встретила красивого принца, которого затем направили в Императорскую гвардию в качестве военного атташе при посольстве России в Риме. Три месяца спустя, после бурного ухаживания, которое «сжег провода», ее отец, генерал Фредерик Дент Грант, объявил о помолвке. Сообщения прессы того времени называли принца «необычайно талантливым и молодым человеком с прекрасным характером», а она «поразительно красивым».

Как и положено красивой дебютантке из высшего общества и красивому дворянину, их свадьба в 1899 году стала кульминацией сезона в Ньюпорте, штат Род-Айленд.

Там американские богачи позолоченного века потирали локти в роскошных особняках, устраивая гламурные вечеринки и коротая дни катаясь на лодках и катаясь на лодках.

Какими бы роскошными они ни были, вечер в Ньюпорте не имел ничего общего с грандиозными делами европейских столиц, с которыми Джулия уже была знакома.

Ее отец был уважаемым дипломатом, назначенным в 1889 году Чрезвычайным посланником и Полномочным министром в Австрии, где она официально дебютировала - очаровательная и талантливая 16-летняя девушка, представленная императору Францу Иосифу на Венском балу. В своей книге «Моя жизнь здесь и там», опубликованной в 1921 году, она вспоминает, как император хвалил ее за способность прекрасно говорить по-венски. Он сказал ей: «Я уверен, что у вас будет большой успех, и я с удовольствием его посмотрю».

После хорошо посещаемой свадьбы в доме тети Берты пара отплыла в Париж на борту частной яхты, а затем поездом в ее новый дом, родовое имение князя Буромка в Полтаве, расположенное в центральной Украине на реке Ворскла. .

В отличие от остального населения, элита России до Первой мировой войны вела роскошный образ жизни в величественных дворцах. Княгиня напомнила, что в Санкт-Петербурге легендарный дворец царя Николая мог вместить 3000 человек в одном бальном зале, и всех их можно было угощать эпикурейскими трапезами «с тарелкой и редким фарфором, подгузниками и едой из его собственных кухонь и кладовых». ”

В 1907 году князь Кантакузин был назначен в штаб великого князя Николая, командующего всеми русскими войсками, и, по словам Юлии, «в течение семи или восьми лет это было постоянным счастьем для моего мужа.

Принцесса ненадолго вернулась в Америку вместе с тетей Бертой в Сарасоту в феврале 1910 года с историческим визитом. Пыльный городок с 840 душами, должно быть, казался маленьким кусочком ее русского поместья, но его красота была неоспоримой и очаровала группу Палмера, которая приехала сюда частным поездом из Чикаго и поместила Сарасоту на карту мира. Джулия писала: «Я влюбилась в эту часть Америки из-за ее солнечного бирюзового неба и моря, а также улыбающихся пейзажей.

Первая мировая война началась в 1914 году, положив конец сказочной жизни европейской королевской семьи - «Лампы гаснут по всей Европе», как выразился Эдвард Грей, - и в 1917 году русская революция охватила эту страну. в упорной борьбе.

К тому времени принц Майкл был генерал-майором и возглавил, как сообщается, последнюю крупную кавалерийскую атаку, в которой участвовало около 15 000 казаков, против австрийской армии.

Он был тяжело ранен в бою, но его выздоровел личный врач царя, и оставшуюся часть войны он провел адъютантом великого князя.

В последовавшем за этим хаосе большевистской революции Кантакузинам, теперь имеющим троих детей, посчастливилось бежать из России живыми.

Именно в Сарасоте королевская семья нашла убежище в особняке Акасиас в заливе Сарасота, доме дяди и тети Берты Палмер, Бенджамина и Лоры Оноре. Там же жила мама Джулии Ида.

Принц прекрасно вписался в свой новый дом и, казалось, был доволен своей жизнью здесь. Он был назначен руководителем Palmer Estates Farms, а также занимал административную должность в качестве вице-президента Palmer Bank, в течение многих лет являвшегося банком подписи Сарасоты.Он был активно вовлечен в бизнес и общественные дела своего нового дома: президент Клуба Киванис (он значился как «генерал принц Майкл Кантакузин»), вице-президент Ассоциации ярмарок Сарасоты, член Клуба лосей и баркасов. .

Юлия стала известным автором и оратором, опубликовав три книги и множество статей для национальных изданий, рассказывающих о ее ярком прошлом. В Вашингтоне, округ Колумбия, она была известна как «откровенная чемпионка Республиканской партии и одна из самых энергичных хозяйок столицы».

В 1934 году Юлия подала иск о разводе и больше не выходила замуж. Она стала великой дамой вашингтонской политики и дожила до 99 лет. Она умерла в 1975 году.

Принц Майкл женился повторно вскоре после завершения развода на Жанетт Дрейпер, и они жили вместе, пока он не скончался в 1955 году в возрасте 79 лет, ведя необычную жизнь.

Его невестка Барбара Дрейпер, которая встретила принца в 1945 году в Сарасоте, вспоминала, что он вел себя как величественный джентльмен. Она сказала, что он никогда не рассказывал о своих приключениях.«Он был замечательным человеком с прекрасным чувством юмора».

HIS 241 Блок 7

HIS 241 Блок 7
HIS 241
Агрегат 7:
Александр I и Наполеон

В июле 1807 г. Александр I, император России, и Наполеон, император Франции, встретились на баржа посреди реки Неман в Тильзите в Восточной Пруссии, чтобы подписать мирный договор и альянс, которые резко изменили баланс сил в Европа в пользу Наполеона.

Насколько я помню, было очень трудные и длительные переговоры о том, как именно организовать встреча императоров на плоту, эл.г., кто уйдет берег первым, кто прибудет первым, кто кого встретит на плоту и т. д. Думаю, я знаю, кто первым был на плоту, но вот дополнительный возможность получения кредита для вас. Проведите небольшое исследование и дайте мне знать как именно это дипломатическая встреча.

Что вы должны делать в этом Отряд
Что вы можете сделать в этом Отряд
  • Прочтите мою заметку об идее Толстого об истории, представленную в его великом романе Война и мир , который относится к 1812 году.
  • Прочтите комментарии Робинсона и Бирда о Священном союзе, 1815
  • Прочтите главы 19 и 20 из книги Мэри Платт Пармеле (1843-1911) «Краткая история России» (1907 г., 4-е издание). Это короткие главы, читать их необязательно.
Некоторые видео, которые вы можете посмотреть на этом устройстве Дополнительные возможности кредита
  • Чтобы получить максимум 50 очков, смотрите Waterloo (1970) и напишите одностраничный документ с оценкой исторической достоверности фильма.Также дайте мне знать, понравился ли вам фильм.
  • Для максимального дополнительного кредита 50 баллов читать Лев Толстой, Война и мир (1863-69) и напишите одностраничный доклад, объясняющий, почему вы читаете всю книга. Также дайте мне знать вашу любимую сцену и почему.
  • Для максимальных дополнительных баллов в 50 баллов читать Марк Рафф, Михаил Сперанский, государственный деятель Императорской России, 1772-1839 гг. (1957) и напишите одностраничную статью, объясняющую, почему Сперанский был не в состоянии провести существенную политическую реформу при Александре I.
  • Чтобы получить максимальный дополнительный балл в 50 баллов, читайте Роджер Паркинсон, Лис Севера: Жизнь Кутузова, генерала войны и мира (1976) и напишите одностраничную статью, в которой кратко осветите некоторые из генерала, и это обсуждает его стратегию в кампании 1812 года.
  • Чтобы получить максимум 25 баллов, напишите абзац, в котором вы сравниваете и Сравните начало вторжения Наполеона в Россию с его концом.

Все материалы по теме сайт защищены авторским правом © 2009-12, Б.Блуа и К. Эванс
За информацией обращайтесь по адресу [email protected]

Новый аптамер РНК идентифицирует бета-субъединицу АТФ-синтазы плазматической мембраны как ранний маркер и терапевтическую мишень при агрессивном раке.

Аннотация

Цель

Первичный рак молочной железы и простаты можно вылечить, но метастатическое заболевание - невозможно. Выявление клеточных факторов, которые предсказывают метастатический потенциал, может определять как прогноз, так и лечение.

Методы

Мы использовали Cell-SELEX для скрининга библиотеки РНК-аптамеров на предмет дифференциального связывания с клеточными линиями рака предстательной железы с высоким значением по сравнению снизкий метастатический потенциал. Масс-спектроскопия, иммуноблоттинг и иммуногистохимия были использованы для идентификации и проверки мишеней аптамеров. Свойства аптамера были протестированы in vitro, на моделях ксенотрансплантатов и в клинических биопсиях. Наборы данных по экспрессии генов были запрошены на предмет ассоциаций-мишеней при раке.

Результаты

Мы идентифицировали новый аптамер (Apt63), который связывается с бета-субъединицей F 1 F o АТФ-синтазы (ATP5B), присутствующей на плазматической мембране некоторых нормальных и раковых клеток.Apt63 связывается с плазматическими мембранами нескольких агрессивных клеточных линий молочной железы и простаты, но не связывается с нормальными эпителиальными клетками молочной железы и предстательной железы и слабо или совсем не связывается с неметастазирующими раковыми клетками; связывание привело к быстрой гибели клеток. Однократная внутривенная инъекция Apt63 индуцировала быстрое избирательное связывание опухолевых клеток и цитотоксичность в опухолях ксенотрансплантата MDA-MB-231, связанную с ядерной транслокацией эндонуклеазы G и фрагментацией ДНК. Apt63 не был токсичен для нетрансформированных эпителиальных клеток in vitro или соседних нормальных тканей in vivo.В массивах ткани рака молочной железы окрашивание плазматической мембраны Apt63 коррелировало со стадией опухоли ( p <0,0001, n = 416) и не зависело от других маркеров рака. В нескольких наборах данных экспрессия ATP5B была значительно увеличена по сравнению с нормальной тканью и отрицательно коррелировала с выживаемостью без метастазов ( p = 0,0063, 0,00039, соответственно) и общей ( p = 0,050, 0,0198) выживаемостью.

Заключение

Связывание Ecto-ATP5B с помощью Apt63 может нарушить важный механизм выживания в подмножестве опухолей с высоким метастатическим потенциалом и определяет новую категорию рака с потенциальной уязвимостью для терапии, направленной на ATP5B.Apt63 - это уникальный инструмент для выяснения функции поверхностной АТФ-синтазы и, возможно, для прогнозирования и лечения метастатического рака груди и простаты.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s10549-019-05174-3) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Экто-АТФ-синтаза, метастазы, рак молочной железы, рак простаты, аптамер, Cell-SELEX

Введение

Локализованный рак предстательной железы и груди хорошо излечим, но после метастазирования в удаленные органы эти виды рака неизбежно приводят к летальному исходу. .Следовательно, важной целью лечения является выявление и использование конкретных уязвимостей метастатической клетки. Другая ключевая цель - предсказать, какие опухоли подвержены высокому риску метастазирования, что позволяет адаптировать потенциально токсичную терапию для тех, кто с наибольшей вероятностью получит пользу. Этим целям способствовало более глубокое понимание генетического дрейфа раковых клеток во время опухолевой прогрессии, что позволяет определенным клеткам приобретать независимость от поддерживающих факторов в исходной ткани, мигрировать в сосудистую сеть, а также выживать и расти на чужеродных участках, таких как печень и кость.В дополнение к генетическим факторам метастатического фенотипа [1–5] было обнаружено, что эпигенетические изменения и изменения на уровне белка определяют агрессивность опухолевых клеток, включая эписомальный перенос микроРНК в соседние нормальные клетки и из них, перепрограммирование опухоли или стромы факторами высвобождается из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, а также изменения метаболизма, вызванные гипоксией опухоли [6–8]. Производство энергии из источников углерода часто нарушается при раке и может быть связано с изменениями эпигенетического состояния клетки, которые способствуют автономному для клеток увеличению агрессивности опухоли (см. Обзор в [8]).Таким образом, тщательный поиск изменений в раковой клетке, способствующих метастазированию, обязательно включает изучение содержания, функции и местоположения белка.

В этом исследовании мы использовали неконтролируемый метод: дифференциальный Cell-SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) для поиска белков, отличающих метастатические от неметастатических субклонов единственной родительской линии клеток рака простаты, LNCaP. Благодаря своей уникальной третичной структуре, специфичной для последовательности, одноцепочечные нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) могут связываться с отдельными белками с высокой специфичностью и аффинностью, сравнимой с таковыми антител.Эти олигонуклеотиды, известные как аптамеры, могут быть модифицированы для обеспечения стабильности в биологических жидкостях, помечены флуоресцентными метками, слиты с другими молекулами и доставлены in vivo, не вызывая иммунного ответа [9]. Cell-SELEX использует живые клетки для отбора аптамеров, которые распознают клеточные белки в их естественном и функциональном состоянии. Дифференциальная ячейка-SELEX применяет тот же метод для идентификации аптамеров, которые различают два типа клеток. Возможность просматривать большое количество (> 2 40 ) последовательностей увеличивает вероятность выявления редких или уникальных различий маркеров поверхности.

Здесь мы сообщаем об идентификации нового аптамера РНК (Apt63), который распознает свойство плазматической мембраны, которое обычно экспрессируется множеством агрессивных клеточных линий и опухолей рака простаты и молочной железы, но проявляет низкую экспрессию или отсутствует в нетрансформированных клетки и нормальные ткани. Мы демонстрируем, что мишенью аптамера является бета-субъединица F 1 F o АТФ-синтазы (ATP5B). Этот белок является каталитическим компонентом конечного фермента клеточного производства АТФ путем окислительного фосфорилирования и расположен на внутренней митохондриальной мембране.ATP5B и другие компоненты комплекса F 1 F o АТФ-синтазы были ранее идентифицированы на плазматической мембране определенных типов клеток и опухолей, где они упоминаются как «экто-АТФ-синтаза»; несколько исследований показали, что комплекс каталитически активен в производстве внеклеточного АТФ [10, 11]. Установлены различные роли этой активности в некоторых типах нормальных клеток, особенно в ангиогенезе, но ее значение и функция при раке остаются неопределенными.Экто-АТФ-синтаза действует как лиганд для ангиостатина и трансдуцирует некоторые из его антипролиферативных и антиангиогенных эффектов [12]. Было показано, что связывание с экто-АТФ-синтазой ангиостатином, непроницаемыми для мембран небольшими молекулами и моноклональными антителами против бета-субъединицы АТР5 способствует гибели клеток в широком диапазоне чувствительных типов клеток, включая HeLa, Leishmania и растительные клетки [13]. и цитаты в нем; [14–16]). Несколько исследований связали экспрессию поверхностной АТФ-синтазы с более агрессивным и более поздним раком [17, 18], предполагая, что активность этого комплекса на поверхности клетки может поддерживать выживание этих агрессивных клеток во время перехода к метастазированию.В этом исследовании мы показываем, что Apt63 отличает агрессивные клеточные линии рака груди и простаты от менее агрессивных конгенных линий и от нетрансформированных клеток, как человеческих, так и мышиных. In vivo Apt63 избирательно связывается с опухолями, экспрессирующими экто-ATP5B, а не с нормальной прилегающей тканью. Функционально связывание Apt63 с плазматической мембраной вызывает селективное уничтожение опухолевых клеток за счет индукции транслокации эндонуклеазы G из митохондрий в ядро, фрагментации ДНК и апоптоза. Мы показываем, что связывание Apt63 с плазматической мембраной в клинических биопсиях тканей сильно коррелирует с продвинутой стадией опухоли, и, как следствие, экспрессия ATP5B в первичных опухолях является прогностическим признаком плохой выживаемости без метастазов и общей выживаемости.Мы предполагаем, что Apt63 может быть полезен для раннего распознавания и лечения новой подгруппы высокоагрессивных первичных злокачественных опухолей молочной железы и простаты, определяемых поверхностной экспрессией ATP5B.

Материалы и методы

Клеточные линии и культура клеток

Клеточные линии рака простаты человека, используемые в скрининге Cell-SELEX, были получены от доктора Кертиса Петтэуэя [19]. Клетки рака простаты человека (PC-3, PC3-ML, RWPE-1) были щедро предоставлены доктором Керри Бернстайном (Университет Майами) , и клеточными линиями рака груди человека (MDA-MB-231, MDA-MB- 436, MCF7, MCF10) были получены из ATCC (Манассас, Вирджиния), линии клеток рака молочной железы мыши (4T1, 67NR, E0771, E0771.LMB) были подарком доктора Барри Хадсона (Университет Майами). Диссоциированные первичные опухолевые линии DT28 и DT22 были щедрым подарком доктора Д. Эль-Эшри (Университет Миннесоты) [20]. Все клеточные линии поддерживались в соответствии с протоколами поставщиков и содержались в инкубаторах для культивирования тканей при 37 ° C, 5% CO. 2 . Все клеточные линии регулярно тестировались на микоплазму с использованием набора MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Walkersville, MD, USA) и установленного протокола ПЦР [21].

Differential Cell-SELEX

Пул аптамеров РНК, используемых для Cell-SELEX, был получен из библиотеки кДНК с общей матрицей: TCT CGG ATC CTC AGC GAG TCG TCT G- (N40) -CCG CAT CGT CCT CCC TA ( где N40 представляет 40 случайных нуклеотидов).Библиотеку кДНК амплифицировали с помощью ПЦР и транскрибировали in vitro с использованием набора для синтеза РНК Durascribe T7 (Lucigene, США) с нуклеазно-стабильными 2ʹ-F-dCTP и 2ʹ-F-dUTP, как описано ранее [22]. Библиотеку аптамеров очищали с помощью набора RNeasy (Qiagen). И родительские клетки, и клетки LNCaP-Pro5 (Pro5) использовали для отрицательного отбора, а LNCaP-LN3 (LN3) - для положительного отбора. Каждый цикл Cell-SELEX состоит из двух раундов отбора, отрицательного и положительного. Родительские клетки LNCaP использовали в первых трех циклах отбора, а клетки Pro5 - в циклах 4–11.В начале каждого цикла 1 мкг библиотеки аптамеров добавляли к 450 мкл PBS, содержащего 0,5 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl 2 (связывающий буфер), и РНК повторно укладывали путем нагревания в течение 5 минут при 67 ° C и охлаждения при комнатная температура (RT) в течение 10 мин. Все клетки, используемые в Cell-SELEX, выращивали в колбах для культивирования 75T с фильтрованными чашками (ThermoFisher Scientific). При 75% конфлюэнтности клетки ненадолго промывали PBS и диссоциировали из колбы путем инкубации с 3 мл трипсин-EDTA (0,25%) без фенолового красного (ThermoFisher Scientific) при комнатной температуре в течение 3 минут.Добавляли 10 мл среды для выращивания, чтобы остановить реакцию трипсин-ЭДТА. Отделенные клетки собирали в конические пробирки на 15 мл (Falcon) и центрифугировали в течение 5 минут в настольной центрифуге 4 ° C (Eppendorf) при 600 × g . Осадки клеток ресуспендировали в 5 мл связывающего буфера и подсчитывали. 2 × 10 5 клеток Pro5 разделяли в свежие пробирки и центрифугировали в настольной центрифуге в течение 5 минут при комнатной температуре; затем осадок клеток ресуспендировали с библиотекой аптамеров и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре на круговом ротаторе для непрерывного перемешивания клеток.Клетки снова центрифугировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и супернатант, содержащий аптамеры, не связанные с отрицательным селектором, собирали и фильтровали, пропуская через стерильные шприцевые фильтры Pall Acrodisc® 0,2 мкм с мембраной Supor® (лаборатория Pall). На этапе положительной селекции 0,5 × 10 5 клеток LN3 сначала инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с 0,1 мг / мл дрожжевой тРНК (Sigma) для уменьшения неспецифического связывания РНК, затем клетки LN3 промывали связывающим буфером, центрифугировали, и осадок клеток ресуспендировали с отфильтрованным супернатантом из отрицательной селекции.Клетки LN3 инкубировали в течение 10 мин на ротаторе при комнатной температуре с последующим выделением всей РНК (включая связанные аптамеры) с использованием реагента Trizol (Invitrogen). РНК-аптамеры транскрибировали из общей РНК с использованием аптамер-специфичного прямого праймера и реакции обратной транскриптазы SuperScript® III (Invitrogen) и амплифицировали из кДНК первой цепи с помощью стандартной ПЦР (95 ° C, 5 ', 3 × (94 ° C 30 ″, 52 ° C 20 дюймов, 72 ° C 25 дюймов), 15 × (94 ° C 30 дюймов, 54 ° C 20 дюймов, 72 ° C 25 дюймов), 72 ° C 5). Последовательности РНК транскрибировали из полученного пула кДНК с использованием набора Durascribe T7, как подробно описано выше, и вводили в следующий цикл Cell-SELEX.Пулы РНК-аптамеров отбирали в циклах 1, 4 и 11. После цикла 11 пулы аптамеров секвенировали, выравнивали и анализировали для отбора кандидатов для дальнейшего изучения, как описано ранее [22, 23].

Создание аптамеров и скремблированных последовательностей для экспериментов in vitro и in vivo

Отобранные аптамеры и скремблированные олигомеры были синтезированы компанией Integrated DNA Technologies (IDT, США) и использованы в качестве матриц для амплификации с помощью ПЦР (95 ° C, 5 ', 3 × (94 ° C 30 дюймов, 52 ° C 20 дюймов, 72 ° C 25 дюймов), 15 × (94 ° C 30 дюймов, 54 ° C 20 дюймов, 72 ° C 25 дюймов), 72 ° C 5 дюймов) с универсальный прямой праймер 5'-GGG GGA ATT CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGG ACG ATG CGG-3 и обратный праймер 5'-TCT CGG ATC CTC AGC GAG TCG TC-3 '(последовательности олигомеров перечислены в онлайн-ресурсе 1).Затем последовательности РНК транскрибировали с помощью набора Durascribe T7 (Lucigene, США) в соответствии с протоколом производителя. РНК-аптамеры и скремблированные последовательности были помечены для экспериментов in vitro с использованием набора для маркировки siRNA Silencer ™ с красителем Cy ™ 3 (Thermo Fisher Scientific) и для экспериментов in vivo с использованием набора для маркировки нуклеиновых кислот Ulysis Alexa Fluor ™ 647 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. рекомендуемые протоколы.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации аптамеров

Клетки высевали в чашки со стеклянным дном 35 мм (MatTek Corporation, Ashland, MA) при плотности 0.3 × 10 6 клеток на чашку и позволяли расти в течение 48 ч до слияния 60–75%. Меченные Cy3 аптамеры добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 нМ и инкубировали с живыми клетками в течение 30 мин при 37 ° C в 5% CO 2 . После инкубации клетки промывали 3 раза в течение 5 минут каждая PBS и фиксировали 10 минут 4% параформальдегидом при комнатной температуре. После фиксации клетки промывали PBS и контрастировали DAPI (Sigma), конечная концентрация 1 мкг, в течение 5 мин. Чтобы определить совместную локализацию на мембране Cy3-Apt63 и антитела ATP5B, клетки выращивали на покровных стеклах в чашках для культивирования тканей диаметром 35 мм и последовательно окрашивали антителами Cy3-Apt63 и AlexaFluor®647 против ATP5B (ab223436, ABCAM) без пермеабилизации. шаг.Для совместной локализации Apt63 и антитела ATP5B в митохондриях клетки обрабатывали 0,05% Triton X-100 в течение 5 минут, трижды промывали PBS, затем инкубировали как с антителом против ATP5B, так и с Cy3-Apt63 AlexaFluor®647. Наконец, клетки контрастировали с DAPI. Для некоторых экспериментов живые клетки сначала окрашивали Cy3-Apt63 с последующей фиксацией, обработкой 0,05% Triton X-100 и контрастным окрашиванием DAPI, как описано выше. Покровные стекла были закреплены с помощью антифадентного реагента ProLong®Gold (Life Technologies).Флуоресцентные изображения получали на конфокальном микроскопе (Leica SP5) с использованием 20-кратного сухого объектива (Leica PL APO CS).

Очистка и идентификация мишени аптамера

Apt63 и скремблированная последовательность (AptScr) подвергали 3'-концевому биотинилированию с использованием набора Pierce ™ RNA 3 'End Desthiobiotinylation Kit (ThermoFisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки LNCaP-LN3 и LNCaP-Pro5 высевали в чашки Петри диаметром 100 мм на 48 ч при плотности 0,5 × 10 6 клеток на чашку и позволяли расти до слияния 60–75%.В день эксперимента клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с комплексами дестиобиотин-РНК-Apt63 или -AptScr, позволяя аптамеру связываться с мишенью. После связывания клетки промывали 3 раза по 5 мин каждую в PBS при комнатной температуре для удаления избытка несвязанных комплексов РНК-дестиобиотин и сшивали путем инкубации с 1% параформальдегидом в течение 2 мин. Затем клетки тщательно промывали 3 раза по 5 мин каждая в PBS при комнатной температуре. Чтобы отделить мембраны от внутриклеточных компонентов, клетки инкубировали в мягком гипотоническом буфере для лизиса, содержащем 1 М Трис-HCl, 5 М NaCl, 50 мМ MgCl, 0.1M DTT и коктейль с ингибитором протеазы в течение 2 мин на льду. Сразу после инкубации клетки осторожно гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса, десять раз на льду, смешивали с магнитными шариками и оставляли на ночь при 4 ° C, чтобы обеспечить захват гибридных комплексов дестиобиотин-аптамер-мишень. На следующий день шарики тщательно промывали реагентами, входящими в набор, и комплексы мишень-аптамер элюировали 30 мкл 8М мочевины в течение 10 мин при 60 ° C. Извлеченные элюаты и общий клеточный лизат разделяли на 4–20% градиентных гелях SDS – PAGE (Bio-Rad, США).Гели окрашивали с использованием наборов Pierce ™ Silver Stain. Распределение полос белка сравнивали между клеточными линиями LNCaP-LN3 и LNCaP-Pro5, и наиболее обогащенную полосу в элюате аптамер-мишень LN3 вырезали, секвенировали с помощью микрокапиллярной LS / MS / MS и анализировали с помощью программного обеспечения SEQUEST в Taplin Mass Spectrometry Facility. (Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс). Предсказанный белок-мишень был подтвержден с помощью гель-электрофореза SDS-PAGE в градиенте 4–20% и вестерн-блоттинга лизатов цельных клеток и элюатов аптамеров с использованием антител ATP5B (ab170947, ABCAM) с рекомбинантным белком ATP5B в качестве положительного контроля (ab92235, ABCAM).

Анализ аффинности связывания аптамера и цитотоксичности in vitro

Мы использовали два независимых метода для оценки цитотоксичности Apt63 в серии клеточных линий in vitro: (1) прямая визуализация цитотоксичности Apt63 с использованием системы анализа живых клеток IncuCyte® S3 и (2) Поглощение SYTOX ™ Green. Аффинность связывания Apt63 с его мембранной мишенью измеряли с использованием системы CellTiter-Glo® (Promega). Подробные процедуры описаны в Интернет-ресурсе 2.

Мышиные модели ксенотрансплантата и цитотоксичность аптамера in vivo

Все эксперименты на животных были одобрены и выполнены в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Университета Майами.Для живой визуализации поглощения и удержания Apt63 опухолью in vivo использовали модель опухоли ксенотрансплантата простаты. Самцам мышей NOD.CB17-Prkdcscid / J (возраст 10 недель, n = 14, Лаборатория Джексона) ортотопически вводили в правую переднюю долю простаты 2 × 10 6 LN3 и 2 × 10 6 Pro5 клетки. Для определения цитотоксичности Apt63 in vivo мы использовали ранее описанную модель мыши с ксенотрансплантатом опухоли молочной железы [24]. Самкам мышей NOD.CB17-Prkdcscid / J (возраст 6-8 недель, n = 39, Лаборатория Джексона) инъецировали 10 6 клеток MDA-MB-231 в жировую подушку молочной железы.В обеих моделях ксенотрансплантатов, когда опухоли пальпировались, 1 нмоль меченного Alexa Fluor ™ 647 Apt63, AptScr или немеченых олигонуклеотидов, суспендированных в 200 мкл PBS, вводили в хвостовую вену в виде одной инъекции. Мышей были визуализированы и умерщвлены в определенные моменты времени. Опухоли и выбранные ткани вскрывали и обрабатывали для дальнейшего анализа. Подробные процедуры описаны в Интернет-ресурсе 2.

Ткань опухоли и массивы биопсии человека FFPE флуоресцентное окрашивание и анализ

Опухоли ксенотрансплантата удаляли у умерщвленных мышей и немедленно замораживали или фиксировали 10% забуференным формалином (VWR, США), залит парафином, и обработано.Микроматрицы ткани предстательной железы и сердцевины молочной железы (ТМА) были приобретены у US Biomax, Inc (Роквилл, Мэриленд). Подробные протоколы окрашивания представлены, как описано в Интернет-ресурсе 2. Микроматрицы биопсии молочной железы человека, окрашенные Cy3-Apt63, были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии на виртуальном слайд-микроскопе (VS120) для обзорных изображений и на конфокальном микроскопе (Leica SP5) для высокого разрешения. -разрешение изображений и оценивается по визуальному присутствию или отсутствию (более или менее 10% клеток, соответственно) мембраноспецифической мечения Apt63.Список TMA с информацией о пациенте, степенью опухоли и стадией, использованных в этом исследовании, и присвоенный балл Apt63 для каждой биопсии, представлен в онлайн-ресурсе 3. Статистический анализ был проведен для коэффициента корреляции Пирсона для окрашивания, специфичного для мембраны аптамера, по сравнению с гистопатологическими степенями. и этапы.

Наборы данных и анализ экспрессии ATP5B

Экспрессия гена

ATP5B была проанализирована в образцах рака простаты и груди, загруженных с Gene Expression Omnibus и с портала Genomic Data Commons Portal.В частности, данные последовательности РНК в FPKM (количество фрагментов на миллион килобаз) и клиническая информация из набора данных аденокарциномы простаты TCGA (TCGA-PRAD [25]) были загружены с портала Genomic Data Commons Portal с использованием функций пакета TCGAbiolinks R и использованы как есть. Уровни экспрессии опухолей простаты ( n = 264) и образцов нормальной ткани простаты ( n = 160) от Penney et al. [26] были загружены из GEO {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE62872", "term_id": "62872"}} GSE62872 как файл матрицы серий и использовались как есть.Исходные данные 545 фиксированных формалином образцов тканей, залитых парафином (FFPE) от первичного рака простаты, были загружены с GEO {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE46691", "term_id" : "46691"}} GSE46691 [27]. Сигналы на уровне зонда были преобразованы в значения экспрессии из файлов CEL с использованием надежной процедуры усреднения для нескольких массивов RMA [28] и ориентированного на ген Entrez настраиваемого CDF для массива Affymetrix Human Exon 1.0 ST (http: //brainarray.mbni.med.umich .edu / Brainarray / Database / CustomCDF / CDF_download.asp; версия 22).Профили экспрессии генов 25 подходящих нормальных и опухолевых тканей груди были загружены из GEO {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE109169", "term_id": "109169"}} GSE109169 [ 29] как файл матрицы серии и используется как есть. Полные медианоцентрированные данные по экспрессии, состоящие из 522 первичных опухолей, 3 метастатических опухолей и 22 нормальных образцов, прилегающих к опухоли, и клиническая информация из набора данных TCGA по инвазивной карциноме молочной железы (TCGA-BRCA; [30]) были загружены с https: / /tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/brca_2012/ и используется как есть.Наконец, мы использовали сборник по раку груди, созданный из коллекции 4640 образцов из 27 основных наборов данных, содержащих данные микрочипов по образцам рака молочной железы, аннотированные с клинической информацией. Компендиум состоит из метаданных данных по экспрессии генов для 3661 уникального образца из 25 независимых когорт [31, 32].

Все анализы данных были выполнены в R (версия 3.5.1) с использованием библиотек Bioconductor (BioC 3.7) и статистических пакетов R. Чтобы идентифицировать две группы опухолей с высокой или низкой экспрессией ATP5B, мы использовали классификатор, описанный в [33], на основе стандартизованной экспрессии (оценки) гена или сигнатуры.Опухоли были классифицированы как ATP5B «Низкий», если оценка ATP5B была отрицательной, и как ATP5B «High», если оценка ATP5B была положительной. Чтобы оценить прогностическую ценность показателя ATP5B, мы использовали метод Каплана – Мейера для оценки вероятности выживаемости без метастазов. Чтобы подтвердить эти результаты, было проведено сравнение кривых Каплана – Мейера с использованием логрангового критерия (Мантеля – Кокса). P-значения были рассчитаны в соответствии со стандартным нормальным асимптотическим распределением с использованием порогового значения 0,05 для значимости. Анализ выживаемости проводился в GraphPad Prism.

Результаты

Идентификация аптамера, распознающего агрессивный рак

В качестве начального подхода к обнаружению признаков рака с высоким метастатическим риском мы выполнили дифференциальный Cell-SELEX, сравнив два субклона одной линии рака простаты (LNCaP) с расходящимся метастатическим потенциалом. . Родительские линии вариантов LNCaP и Pro5, которые являются слабометастатическими, использовали для вычитания библиотеки, в то время как агрессивную линию LN3 использовали для положительного скрининга. Было выполнено 11 циклов отрицательного и положительного отбора (рис.а). Продолжающееся обогащение высокоаффинных LN3-специфических аптамеров отслеживали с помощью флуоресценции SYBR® Green в качестве индикатора отжига. На рисунке b показан анализ кривой RoT в каждом цикле, демонстрирующий прогрессирующее увеличение аффинности связывания и уменьшение сложности аптамеров по мере продвижения отбора. Пулы аптамеров отбирали в циклах 0, 1, 4 и 11 и секвенировали. Последовательности, показывающие частоту выше 1/10 6 в последнем проанализированном цикле (т. Е. Цикл 11), были выбраны для дальнейшего исследования.После этого этапа фильтрации 691 уникальная последовательность была сгруппирована в семейства с использованием программного обеспечения Clustal Omega [34] (рис. C), и репрезентативные аптамеры из каждого из 5 выбранных семейств были отобраны для дальнейшего тестирования.

Идентификация аптамера 63 (Apt63) с помощью дифференциального Cell-SELEX. a Схема процесса скрининга Cell-SELEX (вверху). Представление библиотеки молекул РНК, состоящей из 40 центральных случайных нуклеотидов (многоцветных), фланкированных последовательностями прямого (FP) и обратного (RP) праймеров.Библиотеку подвергали скринингу на предмет дифференциального связывания с поверхностным признаком (ами), уникальным для клеток рака простаты LNCaP-LN3. Отрицательный отбор был проведен с использованием слабометастатических клеток LNCaP-Pro5 (гладкие черные), а положительный отбор был проведен на субклоне LN3 с высокой степенью метастазирования (остроконечный красный). Последовательные отрицательные и положительные циклы отбора обогащают пул аптамеров LN-связывающими последовательностями (вверху справа). Пулы РНК-аптамеров отбирали после циклов 1, 4 и 11 и секвенировали. Последовательности, обогащенные в цикле 11 по сравнению с более ранними циклами, были выровнены и сгруппированы (внизу справа). b Анализ кривой RoT для циклов 0–11. Прогрессивное увеличение аффинности связывания наблюдается по мере уменьшения сложности пула аптамеров. Обогащение для связывания с высоким сродством обнаруживается уже в цикле 3. c Выравнивание 5 последовательностей из (a) , которые тестировали на селективное связывание in vitro с клетками LN3. d Вторичную структуру 2 последовательностей аптамера, демонстрирующих избирательное связывание с клетками LN3 по сравнению с клетками Pro5, определяли с использованием mFold Web Server (Институт РНК, Университет Олбани, Государственный университет Нью-Йорка). e Репрезентативные конфокальные изображения клеток LN3 и Pro5, связанных с Cy3-меченным Apt63 или AptScr. (Цветной рисунок онлайн)

Отобранные аптамеры РНК вместе со скремблированными контролями метили Cy3 и инкубировали с живыми клетками LN3 и Pro5. Аптамеры №63 и №41 продемонстрировали сильное связывание с LN3, в то время как с другими аптамерами и контрольными последовательностями наблюдалась только фоновая флуоресценция (рис. D и онлайн-ресурс 4). Клетки Pro5 не связывались ни с аптамером, ни с скремблированными контролями (рис.d и онлайн-ресурс 4). Из-за большей интенсивности флуоресценции Apt63 эта последовательность была выбрана для дальнейшего тестирования.

Затем мы спросили, будет ли Apt63 предпочтительно взаимодействовать с другими высокометастатическими клеточными линиями, происходящими из других тканей, включая рак предстательной железы человека, молочной железы человека и рака молочной железы мыши. Для сравнения использовали неканцерогенные и слабометастатические клеточные линии (рис.). Как и в случае LN3, агрессивные клеточные линии рака предстательной железы PC-3 и PC3-ML были сильно помечены Apt63, в то время как неканцерогенная эпителиальная клеточная линия предстательной железы RWPE-1 - нет (рис.а). Легко метастазирующие линии клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и MDA-MB-436 также были сильно помечены Apt63, но неканцерогенная линия эпителиальных клеток молочной железы MCF10A не была помечена, а линия клеток с низким уровнем метастазирования MCF-7 была слабо связана. пользователя Apt63. Линия первичной диссоциированной опухоли молочной железы DT28, которая эффективно метастазирует, была сильно помечена Apt63, но неметастазирующая линия DT22 - нет [35]. Apt63 также эффективно различал линии клеток рака молочной железы мышей с разным метастатическим потенциалом (Интернет-ресурс 5), что указывает на межвидовую консервацию связывающей мишени.Живые клетки, окрашенные Apt63, демонстрировали точечный рисунок, который, по-видимому, концентрировался на плазматической мембране с некоторым изменением интенсивности мечения (рис. A, b). Эти данные свидетельствуют о том, что мишень, распознаваемая Apt63, расположена на поверхности клетки и является общей чертой среди клеточных линий с высоким метастатическим потенциалом.

Дискриминационное окрашивание агрессивного рака груди с помощью аптамера 63. Указанные линии раковых клеток в живых в культуре инкубировали с 1 нмоль Cy3-меченного Apt63 (вверху) или AptScr (внизу). a Агрессивные PC-3 и PC-ML показывают положительное окрашивание Apt63; линия эпителиальных клеток простаты RWPE не показывает положительного окрашивания. b Слабометастатический MCF-7, агрессивные клеточные линии рака молочной железы MDA-MB-231 и MDA-MB-436 и агрессивная линия диссоциированной опухоли DT28 демонстрируют мембраноспецифическое окрашивание; линия клеток эпителия молочной железы MCF10A, не образующих опухоль, и линия неметастатической опухоли DT22 не имеют положительного окрашивания. Оригинальное конфокальное увеличение изображения: × 20. (Цветной рисунок онлайн)

Связывание Apt63 избирательно цитотоксично для раковых клеток в культуре и in vivo

Мы предположили, что мишень Apt63 на клетках LN3 может иметь функциональное значение для стимулирования его метастатического фенотипа, возможно, как фактор выживания, и это связывание аптамером может нарушить эту функцию.Соответственно, мы проверили прямую цитотоксичность Apt63 in vitro, используя два метода. Во-первых, цитотоксичность в реальном времени контролировали в клетках LN3, подвергнутых воздействию Apt63, по поглощению и флуоресценции SYTOX® Green с использованием системы анализа живых клеток IncuCyte® S3. Краситель нуклеиновой кислоты SYTOX® Green исключается здоровыми клетками с нормальной проницаемостью мембраны, но пассивно диффундирует через поврежденные мембраны. После добавления Apt63 или скремблированного аптамера (AptScr) вместе с SYTOX® Green флуоресцентные изображения записывались каждые 5 минут в течение всего эксперимента (рис.а; см. также покадровое видео в Интернет-ресурсе 6). Не было обнаружено различий в гибели клеток между различными условиями через 20 мин (рис. А). К 100 мин большинство клеток LN3, подвергшихся воздействию Apt63, стали ярко флуоресцентными, что указывает на цитотоксичность, но не было изменений в продолжающейся базовой смертности клеток LN3, обработанных Pro5 или AptScr (рис. A). Эти данные свидетельствуют о том, что Apt63 вызывает быструю гибель клеток при взаимодействии с эпитопом, обогащенным LN3, что приводит к нарушению целостности мембраны и гибели клеток в течение 2 часов. Затем мы оценили дозовую зависимость цитотоксичности Apt63 в клетках LN3, используя содержание АТФ в качестве индикатора жизнеспособности клеток.Клетки подвергали воздействию Apt63 в диапазоне концентраций и флуоресценции АТФ в среде, определяемой с использованием системы CellTiter-Glo®, как описано в разделе «Материалы и методы». Относительно резкое снижение жизнеспособности клеток наблюдается при приблизительной IC50 = 1,030 нМ ( R 2 = 0,9497, рис. B). Для сравнения, IC50 для ангиостатина в этом анализе составляла 1,66 мкМ ( R 2 = 0,884. Фиг. B).

Связывание Apt63 избирательно цитотоксично для раковых клеток в культуре и in vivo. a Быстрая цитотоксичность in vitro, индуцированная Apt63. Смерть клеток отслеживалась в реальном времени с помощью флуоресценции SYTOX® Green, как описано в разделе «Материалы и методы». Репрезентативные фотографии через 10 минут (левая колонка) и через 2 часа после обработки (правая колонка). Оригинальное увеличение: × 20. b Зависимость цитотоксичности Apt63 от концентрации. К клеткам добавляли Apt63 (немеченый) или ангиостатин в указанных концентрациях и измеряли люминесценцию люциферина через 2 часа в планшет-ридере EnVision ™.Показания нормализовали к необработанным клеткам и наносили на график с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8. Apt63 IC50 = 1,030 нМ. IC50 для ангиостатина = 1,66 мкмоль (> 10 3 × выше). c Клеточная селективность цитотоксичности Apt63. Указанные клеточные линии инкубировали с Apt63 или скремблированным аптамером (AptScr) в присутствии SYTOX® Green. Ось Y показывает абсолютные единицы флуоресценции через 3 часа. d, e Селективное поглощение Apt63 опухолями ксенотрансплантата LN3 после внутривенной инъекции in vivo.Ксенотрансплантаты ортотопических опухолей LN3 и Pro5 были созданы у мышей, как описано в разделе «Материалы и методы», и меченный Alexa Fluor 647 Apt63 или AptScr вводили через хвостовую вену. d Репрезентативные изображения in vivo через 3,5 часа после инъекции на системе визуализации IVIS Spectrum in vivo (Perkin Elmer). Стрелки указывают положение опухолей ксенотрансплантата у мышей, которым инъецировали Apt63; кружок указывает на место вскрытия легочного абсцесса. и . Селективное поглощение Apt63 клетками LN3. Замороженные срезы опухолей, удаленных у животных через 4 ч после доставки меченого аптамера, контрастировали с DAPI.Показаны репрезентативные флуоресцентные изображения. f Apt63 связывается и индуцирует ядерную фрагментацию в опухолях ксенотрансплантата молочной железы MDA-MB-231 in vivo. Ортотопические ксенотрансплантаты MDA-MB-231 были созданы, как описано в разделе «Материалы и методы». Мыши получали однократную инъекцию 1 нмоль Apt63 в хвостовую вену, как в ( d ), выше, и были умерщвлены через 6, 24, 48 часов. Замороженные срезы ксенотрансплантата получали, как в ( и ). Репрезентативные изображения опухолей, меченных AptScr- (вверху) и Apt63- (в центре), в каждый момент времени.Обратите внимание на сохранение флуоресцентной метки и повышенную фрагментацию ядра в ксенотрансплантатах, подвергнутых воздействию Apt63 (стрелки). (Внизу) Увеличенные изображения, показывающие опухоли ксенотрансплантата, окрашенные DAPI, через 48 часов после инъекции AptScr и Apt63. Стрелки указывают на фрагментированные ядра MDA-MB-231 в опухолях, подвергшихся воздействию Apt63. г Структура нуклеосомного расщепления в клетках, обработанных Apt63. Фрагментацию ДНК в опухолях, обработанных Apt63, подтверждали электрофорезом общей геномной ДНК. Электрофорез опухолевой ДНК показывает накопление продуктов расщепления ДНК размером 300–400 п.н. (стрелки). ч. Apt63 индуцирует транслокацию EndoG из митохондрий в ядра. Замороженные срезы ксенотрансплантата через 24 часа окрашивали кроличьими поликлональными антителами EndoG (ab9647, ABCAM) и контрастировали с помощью DAPI. (Цветной рисунок онлайн)

Чтобы определить, коррелировали ли связывание Apt63 и цитотоксичность в других линиях клеток, мы выращивали человеческие PC3, PC3ML, RWPE, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MCF7, MCF10A и мышиные T41 и Клеточные линии NR 67 вместе с исходными клеточными линиями LN3 и Pro5 в 96-луночных планшетах в течение 24 часов.Каждую клеточную линию обрабатывали немеченым 1 нМ Apt63 и 5 нМ красителем SYTOX® Green в течение 3 часов. Связывание Apt63 с живыми клетками в культуре тесно коррелировало с быстрой цитотоксичностью, как показано флуоресценцией SYTOX® Green (рис. C, красные столбцы; сравните рис. A). С AptScr не наблюдалось гибели клеток (синие столбцы). Неканцерогенные эпителиальные клеточные линии RWPE и MCF10A, которые не связывают Apt63, были полностью устойчивыми, тогда как клеточные линии со слабым окрашиванием имели соответственно пониженную чувствительность (например, MCF-7) (рис.в). Остаточная токсичность Apt63 в этих слабо окрашиваемых клетках может отражать присутствие небольших субпопуляций уязвимых клеток. В целом, однако, эти данные позволяют предположить, что цитотоксичность Apt63 является последовательной и зависит от наличия специфического эпитопа, обнаруженного на множестве типов раковых клеток.

Затем мы спросили, может ли Apt63 проявлять специфическое для последовательности связывание и токсичность для клеток, выращенных как опухоли ксенотрансплантата in vivo. В начальных экспериментах мы проверили, будут ли опухолевые клетки LN3 и Pro5 по-разному поглощать Apt63 после внутривенной инъекции.Мышам, несущим опухоли ксенотрансплантата LN3 и Pro5, вводили однократную дозу 1 нмоль меченного Alexa Fluor ™ 647 Apt63 или AptScr в 200 мкл PBS в хвостовую вену. Между 10 мин и 3,5 ч после инъекции захват Apt63 можно было обнаружить в ксенотрансплантатах LN3, но не Pro5 in vivo (фиг. D) и в замороженных срезах тех же опухолей (фиг. E). Поглощение Apt63 не наблюдалось в ксенотрансплантатах Pro5 (фиг. D), что позволяет предположить, что Apt63 избирательно связывается и накапливается в опухолях, экспрессирующих его мишень плазматической мембраны.Затем мы вводили меченный Alexa Fluor TM Apt63 или AptScr мышам, несущим опухоли ксенотрансплантата MDA-MB-231 в жировой подушке молочной железы. За мышами наблюдали и умерщвляли через 6, 24 и 48 часов после однократной инъекции Apt63 или AptScr в хвостовую вену, и визуализировали замороженные срезы опухолей, как описано выше. Флуоресцентная метка сохранялась ксенотрансплантатами MDA-MB-231, подвергшимися воздействию Apt63, в течение 48 часов после инъекции, в то время как в любой точке можно было обнаружить только фоновый сигнал AptScr (рис. F).

На тех же изображениях мы отметили увеличение фрагментации ядер в ксенотрансплантатах MDA-MB-231 через 24 ч после инъекции Apt63 по сравнению с AptScr (рис.е). Мы дополнительно исследовали это с помощью электрофореза опухолевой ДНК (рис. G), который выявил отчетливую картину расщепления нуклеосомной ДНК в опухолях, обработанных Apt63. Паттерн расщепления напоминал паттерн, продуцируемый эндонуклеазой G (endoG), нуклеазой, которая высвобождается из межмитохондриального мембранного пространства во время окислительного стресса и перемещается в ядро, чтобы инициировать каспазно-независимый путь апоптоза [36, 37]. В соответствии с этим, опухоли MDA-MB-231, обработанные Apt63, показали значительное ядерное окрашивание endoG к 24 часам, в то время как опухоли, обработанные AptScr, не показали (рис.h, наконечники стрелок). Эти эффекты не сопровождались какой-либо видимой цитотоксичностью по отношению к соседним неопухолевым тканям или какими-либо очевидными неблагоприятными эффектами на общее состояние мышей в течение 48 часов после инъекции. Мы интерпретируем эти результаты, чтобы показать, что Apt63 связывается преимущественно с опухолевыми клетками груди и простаты, которые экспрессируют его мишень плазматической мембраны, и что Apt63 индуцирует гибель клеток при связывании посредством механизма, который включает высвобождение и ядерную транслокацию endoG.

Мишенью Apt63 является бета-субъединица F

1 F o АТФ-синтаза (ATP5B)

Для получения обогащенной фракции аптамера-мишени на плазматических мембранах LN3 мы использовали протокол, сочетающий короткую обработку детергентом с мягкий гипотонический лизис для отделения мембранных белков, связанных с аптамером, от других компонентов клетки (см. «Материалы и методы»).Электрофорез этой фракции давал единственную преобладающую полосу белка (фиг. А, дорожка 2.) Аналогичная полоса белка была идентифицирована во фракциях мембран PC-3 (не показаны). Эти полосы были выделены и отправлены на секвенирование белков с помощью масс-спектрометрии ( n = 2 образца из LN3, n = 1 из PC3). Наибольшим успехом во всех трех образцах оказался ATP5B с обнаружением 28,36% последовательности белка ATP5B (таблица).

Идентификация мишени Apt63 как поверхности клетки F o F 1 -АТФ-синтаза β-субъединица ATP5B. a Apt63 связывается с белком 56kd в плазматической мембране LNCaP-LN3. Типичный гель SDS-PAGE белков, иммунопреципитирующих с Apt63 из линий клеток LN3 и Pro5. Дорожка 1: лизат цельных клеток LN3; Дорожка 2: LN3, мембранно-обогащенная фракция; Дорожка 3: общий клеточный лизат Pro5; Дорожка 4: обогащенная мембраной фракция Pro5. В каждую дорожку загружали равные количества белка. Столбик на 56 кДа указывает на преобладающую полосу, ассоциированную с аптамером LN3, после масс-спектроскопии, как описано в разделе «Материалы и методы» и в таблице. b Подтверждение F o F 1 β-субъединица -АТФ-синтазы в качестве мишени аптамера. Мембранные фракции клеток простаты LN3 и Pro5 разделяли, как в (a) . Связанные с плазматической мембраной комплексы Apt63 / мишень (дорожки 1–3) и лизаты целых клеток (дорожки 4–5) получали из указанных клеточных линий и подвергали иммуноблоттингу с моноклональным антителом против ATP5B. Одиночная полоса белка ~ 56 кДа, мигрирующая вместе с рекомбинантным ATP5B (дорожка 6), присутствует на мембранах LN3 (дорожки 1, 2), но не Pro5 клеток (дорожка 3).Подобные полосы присутствуют в лизатах цельных клеток обеих клеточных линий, отражая митохондриальный белок (дорожки 4–5). c Apt63 совместно локализуется на плазматической мембране с антителом против ATP5B. Антитело ATP5B (зеленый) и Apt63 (красный) связывали с живыми клетками LN3 с последующей фиксацией и визуализацией с помощью конфокального микроскопа. d Мишень Apt63 извлекается путем обработки фиксированных клеток детергентом. (слева) Cy3-Apt63 (красный) и маркер плазматической мембраны WGA (зеленый) инкубировали с живыми клетками с последующей фиксацией и визуализацией, как в (c) .(справа) Клетки, обработанные аналогичным образом, за исключением того, что фиксированные слайды были подвергнуты короткой обработке 0,05% Triton X-100. Обратите внимание на потерю сигнала Cy3 Apt63 от плазматической мембраны. e Apt63 окрашивает митохондрии в проницаемых клетках. Клетки фиксировали, затем пермеабилизировали 0,05% Triton X-100 и инкубировали с Cy3-Apt63 или Cy3-AptScr и антителом к ​​ATP5B. В этих проницаемых клетках LN3 окрашивание антителами Apt63 и ATP5B совместно локализуется в митохондриях. (Цветной рисунок онлайн)

Таблица 1

Масс-спектроскопия мембранных белков, иммунопреципитированных из LN3 и PC-3 с помощью Apt63.Отдельные эксперименты и запуски MS были выполнены для каждой клеточной линии. Аминокислотная последовательность ATP5B показана ниже с картированными пептидами курсивом

Клеточная линия Масса белка Аминокислоты Идентифицированные аминокислоты Покрытие белка (%) Идентифицированные пептиды
LN3 56524,61 529 118 AA 22,31 14
PC-3 56524.61 529 109 AA 20.60 13
Всего 150 AA 28,36 27

Подтвердите идентичность цели вестерн-блоттинг белков клеточной мембраны, ассоциированных с аптамером, и общих клеточных лизатов с использованием антитела ATP5B (рис. b). Одна белковая полоса присутствовала во фракциях мембран LN3, связанных с Apt63 (рис. B, дорожки 1, 2), но не в клетках Pro5 (рис.б, дорожка 3). Одна и та же полоса легко обнаруживалась в лизатах цельных клеток обеих клеточных линий (фиг. C, дорожки 4, 5) и мигрировала совместно с рекомбинантным белком ATP5B (c, дорожка 6). Антитело ATP5B и Apt63 совместно локализованы на поверхности интактных клеток LN3 (рис. D) и внутри митохондрий в проницаемых клетках LN3 (рис. E), что согласуется с эктопически экспрессируемым ATP5B на плазматической мембране в качестве общей мишени антитела и Apt63. Эта поверхностная мишень может быть извлечена с помощью обработки детергентом (рис. D, справа), дополнительно поддерживая расположение ATP5B на плазматической мембране.

Мембрана ATP5B как коррелят метастазов опухоли в клинических популяциях

Неясно, как экспрессия гена ATP5B и уровни экто-ATP5B связаны в любом данном типе клеток; Белок ATP5B подвергается значительной посттрансляционной и функциональной регуляции, включая перераспределение плазматической мембраны [16, 38–41]. Однако сообщалось, что некоторые компоненты комплекса АТФ-синтазы активируются при раке [40, 42, 43]. Поэтому мы спросили, связана ли экспрессия ATP5B с фенотипами рака в клинических популяциях, сравнив уровни транскрипта ATP5B в опухоли и в опухоли.нормальные ткани в нескольких наборах данных по раку простаты и груди. Экспрессия ATP5B была значительно выше в первичных опухолях по сравнению с нормальными тканями как в простате (рис. A – c), так и при инвазивном протоковом раке молочной железы (рис. D, e). В тандеме с этим среднее количество копий АТФ было значительно увеличено в ER-положительных опухолях и в подмножестве ER- (рис. F), хотя, что интересно, среднее количество копий для ER- опухолей было снижено. Для обоих типов рака экспрессия ATP5B выше медианы была связана со значительным снижением отсутствия метастазов (рис.а, б) и общая (рис. в, г) выживаемость. Эти данные согласуются с ролью ATP5B, наряду с другими членами комплекса, в поддержке метастатического прогрессирования.

Экспрессия ATP5B повышена при раке простаты и груди по сравнению с нормальной тканью. Наборы данных были проанализированы, как описано в разделе «Материалы и методы». a Экспрессия ATP5B повышена при аденокарциноме простаты по сравнению с нормальной тканью простаты ( p = 3,54e-4). GS = стадия Глисона. Данные Vanaja et al.[74]. b Сверхэкспрессия ATP5B в {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE62872", "term_id": "62872"}} GSE62872 образцов простаты по сравнению с нормальными тканями простаты ( n = 424; p -значение <0,0001). c Сверхэкспрессия ATP5B в образцах TCGA-PRAD по сравнению с нормальными тканями простаты ( n = 551; p -значение = 0,0001). d Сверхэкспрессия ATP5B в {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE109169", "term_id": "109169"}} GSE109169 рака груди по сравнению с их парными нормальными аналогами ( n = 50; p -значение = 0.0004). Серые линии связывают нормальные и парные образцы опухоли. e Сверхэкспрессия ATP5B при раке протоков молочной железы по сравнению с нормальными тканями молочной железы ( n = 544; p -значение = 0,0005). Данные получены из базы данных TCGA-BRCA. f Изменение количества копий ATP5B при раке груди по сравнению с нормальными клетками крови. Число копий значительно увеличивается в опухолях ER +. Данные из набора данных TCGA Breast 2. (Цветной рисунок онлайн)

Повышенная экспрессия ATP5B связана с повышенным риском метастазирования и снижением общей выживаемости при раке простаты и груди. a Экспрессия ATP5B повышена в первичных опухолях простаты, которые позже метастазируют. Первичный рак простаты с прогрессированием метастазов сравнивали с образцами без признаков метастазирования. Данные были получены из {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE46691", "term_id": "46691"}} GSE46691 [27] ( n = 545; p -значение = 0,0063). b Высокая экспрессия мРНК ATP5B коррелирует со снижением общей выживаемости у пациентов с раком простаты из набора данных TCGA-PRAD ( n = 551).Пациенты с высокой и низкой экспрессией ATP5B показаны красным и синим цветом соответственно (см. «Материалы и методы»). Пациенты с высокой экспрессией ( n = 250) имели более низкую общую вероятность выживания с течением времени (логарифмический ранг p -значение = 0,050). c Высокая экспрессия мРНК ATP5B коррелирует со снижением выживаемости без метастазов у ​​пациентов из сборника из 3661 образцов рака молочной железы. Пациенты с высокой и низкой экспрессией ATP5B показаны красным и синим цветом соответственно (см. «Материалы и методы»).Пациенты с высоким уровнем экспрессии ( n = 1656) имели более высокую вероятность развития метастазов с течением времени (логарифмический ранг p -значение = 0,0039). d Высокая экспрессия мРНК ATP5B коррелирует с плохой общей выживаемостью у пациентов с раком груди из набора данных TCGA-BRCA ( n = 522). Пациенты с высокой и низкой экспрессией ATP5B показаны красным и синим цветом соответственно (см. «Материалы и методы»). Пациенты с высоким уровнем экспрессии ( n = 263) имели более низкую общую вероятность выживания с течением времени (логарифмический ранг p -значение = 0.0198). (Цветной рисунок онлайн)

Чтобы охарактеризовать содержание белка ATP5B в образцах рака груди и простаты человека, мы использовали Apt63 для маркировки микрочипов ткани рака простаты и молочной железы (ТМА), представляющих диапазон классов и стадий опухоли. Как и в исследованиях ксенотрансплантатов, показанных выше, мы подтвердили, что окрашивание Apt63 совместно локализовано с окрашиванием моноклональным антителом ATP5B в опухолевой ткани, в то время как нормальная прилегающая строма лишь минимально связывалась любым из реагентов (рис. А). Образцы окрашивания как цитозола, так и мембраны могут быть идентифицированы с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения.Мы наблюдали значительную неоднородность образцов окрашивания для разных категорий рака груди; в некоторых опухолях Apt63 преимущественно метил цитозольные компоненты, включая митохондрии, тогда как в других был идентифицирован четкий паттерн плазматической мембраны (рис. b). Окрашивание нормальной ткани, прилегающей к опухоли, было неизменно слабым (рис. B, скобки). Используя полуколичественный показатель наличия или отсутствия мембраносвязанного ATP5B (см. Онлайн-ресурс 2), мы не увидели устойчивой связи между наличием экто-ATP5B и степенью опухоли, подтипом PAM50 или статусом рецептора гормона.Однако окрашивание плазматической мембраны клеток рака груди с помощью Apt63 было сильно и положительно связано со стадией опухоли ( r = 0,997, p = 3,12E-03), проявляясь в 42/46 метастазов в лимфатические узлы, 0/12 в норме. образцы ткани молочной железы и промежуточные значения при DCIS и инвазивных карциномах (сводка представлена ​​в таблице и в онлайн-ресурсе 3). Эти результаты обеспечивают дополнительную поддержку функциональной взаимосвязи между ATP5B плазматической мембраны, на что указывает связывание Apt63, и метастазами рака груди.

Apt63 связывается с подмножеством агрессивных опухолей молочной железы и локализуется совместно с ATP5B. a Биопсия ядра первичной опухоли (верхний ряд) и прилегающих нормальных тканей (нижний ряд) с анти-ATP5B (Abcam # 14730) с использованием HRP (крайний слева) или антител Alexa Fluor® 647 ATP5B (ab223436, ABCAM) (слева) . ATP5B (обозначен зеленым цветом) и Cy3-Apt63 (красный цвет) широко совместно локализуются как на клеточных мембранах, так и в цитозоле. b Гетерогенное связывание Cy3-Apt63 с первичными опухолями молочной железы и метастазами в лимфатические узлы.Скобками обозначены нормальные прилегающие ткани в верхнем ряду. c – f Репрезентативные конфокальные изображения с высоким разрешением нормальной ткани (c) , протоковой карциномы in situ (DCIS) (d) , инвазивной протоковой карциномы (CA) (e) и метастазов в лимфатические узлы ( LN) (f) , изображение получено с помощью Cy3-Apt63. Картина окрашивания мембраны, а также окраска цитозоля можно увидеть в (e) и (f) . Исходное увеличение: х20. Показанные результаты являются репрезентативными для 417 биопсий груди.(Цветной рисунок онлайн)

Таблица 2

Биопсия ткани по группам патологий и оценка окрашивания мембраны Apt63

45 45 Нормальная грудь ткань .79 109 9060 Грудь 109 9060
Ткань Apt63 положительная Всего образцов Процент (%)
0 12 0,00
Доброкачественные опухоли 4 31 12,90
Нормальная ткань молочной железы, прилегающая к раку 3 19 15
Грудь Инвазивная дольчатая СА * 11 30 36,67
Протоковая СА * in situ 10 22 инвазивная 45,45
45,45
198 55,05
Метастазы в лимфатические узлы 42 46 91,30

Обсуждение

Здесь мы показываем, что эктопическая плазматическая мембрана ATP5B 9069 - субъединица АТФ-синтаза обозначает фенотип с высоким риском метастазирования при раке груди и простаты и уязвимость раковых клеток in vivo .F 1 F o АТФ-синтаза представляет собой высококонсервативный ферментный комплекс, расположенный на внутренней митохондриальной мембране, где он выполняет заключительную стадию окислительного производства АТФ. Его 30 белковых компонентов организованы в два домена: домен, перемещающий протоны F o , и каталитический домен F 1 [44, 45]. Три пары субъединиц ATP5A и ATP5B образуют каталитическое ядро ​​F 1 во внутренней митохондриальной мембране, генерируя молекулы ATP, когда H + проходит через поры F o .Дефекты АТФ-синтазы способствуют возникновению заболеваний, включая микробные инфекции, иммунодефицит, невропатии, ожирение, диабет и рак [35, 46, 47].

АТФ-синтаза, расположенная на плазматической мембране (экто-АТФ-синтаза), была первоначально открыта как неоантиген рака более 20 лет назад [48]. Полнофункциональные комплексы АТФ-синтазы были идентифицированы на плазматической мембране некоторых нормальных и многих опухолевых клеток и могут либо гидролизовать, либо синтезировать АТФ [10, 11]. Было высказано предположение, что экто-АТФ-синтаза действует как рецептор для апо-A1 и тем самым регулирует захват HDL гепатоцитами [49, 50] и способствует пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников и ангиогенезу [51].Было показано, что ангиостатин связывается с экто-АТФ-синтазой и нарушает ее синтетическую активность АТФ, что способствует его антиангиогенному действию [10, 52]. Однако ангиостатин способен осуществлять эти функции через другие рецепторы на поверхности клетки, включая c-met [53], протеогликан NG2 [54] и аннексин II [55]. Важность этих функций экто-АТФ-синтазы в нормальных клетках еще предстоит полностью выяснить [38, 56].

ATP5B появился в нашем объективном скрининге как особенность плазматической мембраны, которая отличает агрессивную клеточную линию LNCaP-LN3 от изогенных клеток LNCaP и LNCaP-Pro5, которые нечасто метастазируют [19].В совокупности наши данные предполагают, что приобретение этой особенности могло активировать метастатический фенотип субклона LN3. Несмотря на значительные усилия, никаких других специфических драйверов агрессивного фенотипа LN3 идентифицировано не было. Клетки LN3 хорошо растут в отсутствие андрогенов, но не имеют амплификации рецепторов андрогенов [57]; LN3 также проявляет более высокую устойчивость к апоптозу, связанную с повышающей регуляцией антиапоптотического BCL-2 и понижающей регуляцией BAK и BAX [57]. LN3 экспрессируют более высокие уровни ингибирующего макрофаги цитокина-1 (MIC1 / GDF15) [58], шаперона gp96 [59] и VEGFA [60] и обладают большей васкуляризацией опухоли [59, 60], чем неметастатические линии LNCaP.Не было показано, что генетические различия объясняют эти свойства, хотя LN3 обнаруживает уникальные делеции в 16q23-qter и 21q неизвестной функциональной значимости [61] и не имеет миссенс-мутации в PlexinB1, обнаруживаемой в родительских клетках LNCaP, которые, по-видимому, молчащие [62]. Предыдущие протеомные анализы не обнаружили признаков, отличающих LN3 от менее агрессивных изогенных линий [63]. В том же исследовании было обнаружено, что белок эндоплазматического ретикулума ERp5 сверхэкспрессируется и отображается на плазматической мембране как LN3, так и Pro5 клеток, демонстрируя, что цикл внутриклеточных пептидов на плазматической мембране не является редким событием во время туморогенеза [63].

Значительные доказательства связи экто-АТФ-синтазы с агрессивным ростом раковых клеток. Связанные с плазматической мембраной субъединицы ATP5, включая ATP5B, коррелируют с более агрессивными, более крупными и более развитыми опухолями при множественных раковых заболеваниях, включая рак груди, легких и простаты [17, 42, 64]. В нашем ТМА-анализе связывания Apt63 рака молочной железы, включая биопсии, представляющие 416 субъектов, поверхностный ATP5B, по-видимому, определяет уникальную подгруппу высокоагрессивных видов рака молочной железы и предстательной железы, присутствующих в 45% DCIS и 55% инвазивных карцином протоков и почти на всех (91.3%) метастазы в лимфатические узлы. Окрашивание Apt63 не соответствовало размеру опухоли или статусу рецептора гормона, что позволяет предположить, что экто-ATP5B обозначает независимый фенотип опухоли. Поверхностный ATP5B также, по-видимому, важен как опухолеспецифический фактор выживания: раковые клетки, экспрессирующие экто-ATP5B, были быстро убиты связыванием Apt63, подвергаясь ядерной транслокации эндонуклеазы G и фрагментации ДНК, в то время как соседние нормальные ткани были сохранены. Эта избирательная токсичность может означать, что определенные опухоли груди и простаты зависят от присутствия функциональной экто-АТФ-синтазы, и указывает на уязвимость, которой не обладают нетрансформированные клетки.

Биологическое значение экто-АТФазы было исследовано с использованием ряда физиологических и синтетических лигандов, включая ангиостатин, плазминоген, моноклональные антитела, пептиды и небольшие молекулы, связывающиеся с модулем F 1 [12, 14, 16, 64 –67]. Эффекты этих агентов зависят как от типа клеток, так и от лиганда, но большинство из них снижает выработку внеклеточного АТФ и пролиферацию клеток, а некоторые инициируют запрограммированную смерть. В HUVEC, которые экспрессируют высокие уровни экто-АТФ-синтазы, ангиостатин ингибировал пролиферацию клеток и продукцию АТФ, но не был цитотоксичным [10]; в клетках рака легкого A549 и ангиостатин, и поликлональное антитело против ATP5B блокировали синтез АТФ, вызывали внутриклеточное закисление и запускали гибель клеток [68].Моноклональное антитело к ATP5B (McAb178-5G10) ингибировало генерацию поверхностного АТФ и ингибировало пролиферацию HUVEC и клеток MDA-MB-231, но само по себе не было токсичным [69]. Это же антитело индуцировало апоптоз в клетках A549, сопровождающийся падением внеклеточного АТФ, внутриклеточного pH и фосфорилирования ERK и AKT [14]. Другое моноклональное антитело против ATP5B (mAb6F2C4) ингибировало внеклеточный синтез, пролиферацию и образование колоний, не зависящих от закрепления, клеточной линии гепатомы SMMC-7721 [65]; это антитело также могло снижать рост ксенотрансплантата гепатомы in vivo.Крингл-1–5 домен плазминогена, лиганда экто-АТФ-синтазы, запускает каспазозависимый апоптоз в эндотелиальных клетках [52]. С другой стороны, связывание аполипопротеина A1 с экто-АТФ-синтазой способствует выживанию и дифференцировке эндотелиальных клеток-предшественников [51]. Различия в сайтах связывания, эффекты на конформацию ферментов и белковые взаимодействия лигандов АТФ-синтазы могут объяснить эти дивергентные эффекты. Дополнительные факторы микросреды, включая кислый внеклеточный pH, могут способствовать селективному уничтожению опухолей [13, 65].Дальнейшие исследования потребуются для выяснения конкретных механизмов запрограммированной гибели клеток, вызванной Apt63, при раке груди и простаты, включая влияние на внеклеточный pH, активные формы кислорода и пуринергические нуклеотиды.

Количественная взаимосвязь между экспрессией гена ATP5B и поверхностной АТФ-синтазой не определена и, вероятно, сложна: субъединицы АТФ-синтазы кодируются как ядерным, так и митохондриальным геномами и скоординированно регулируются с помощью не полностью определенных трансляционных и посттрансляционных средств [38, 39, 41 , 70–72].Тем не менее, ассоциации, которые мы идентифицировали между экспрессией гена ATP5B и выживаемостью без метастазов и общей выживаемостью при раке груди и простаты, замечательны. Возможно, протеомный анализ продемонстрирует еще более сильные связи. Сравнивая протеомы рака молочной железы MCF-7 и высокоинвазивного субклона, Pan et al. [42] обнаружили, что другая субъединица АТФ-синтазы, ATP5A, сверхэкспрессируется в агрессивном субклоне. ATP5A был идентифицирован на поверхности этих клеток, а также на линиях клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и MDA-MB-453, но не на родительских клетках MCF-7 или на неканцерогенных эпителиальных клетках молочной железы MCF-10F. [42].Параллельно повышенная иммунореактивность ATP5A наблюдалась в 94% случаев рака груди, а также в 21,2% нормальных тканей. Этот анализ не различает мембранное и цитозольное окрашивание, но результаты согласуются с взаимосвязью между уровнями белка АТФ5 и появлением на плазматической мембране. Другие исследователи показали, что ATP5B и другие субъединицы АТФ-синтазы перемещаются по липидным плотам, которые могут перемещаться между митохондриальной и плазматической мембранами [16, 73]; совместная локализация с кавеолином-1 может потребоваться для поддержания функционального поверхностного комплекса в эндотелии сосудов [73].Будет важно изучить степень, в которой экспрессия ATP5B коррелирует с поверхностным ATP5B в будущих клинических исследованиях прогноза рака груди.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *