Шида каин: Каин, Сумеречный жнец — League of Legends

Содержание

[Обучение Patch 11.13] Каин Aram, Рекомендованные Предметы | Таланты | Руны | Заклинания Призывателя

Потрошитель

КУПИТЬ: 3300

ПРОДАТЬ: 2310

45 силы атаки
400 здоровья
20 ускорения умений
150% базового восстановления здоровья

Активно –Жадный порез: наносит (100% от силы атаки) физического урона врагам поблизости. Восстанавливает (25% от силы атаки + 10% от недостающего здоровья) здоровья за каждого пораженного чемпиона (перезарядка – 15 сек., сокращается ускорением умений).

  • Закипание: дает 1% силы атаки за каждые 5% недостающего здоровья (вплоть до 15%).

    Мифический пассивный эффект: все остальные легендарные предметы дают 5 ускорения умений.

  • Ионийские сапоги просветления

    КУПИТЬ: 950

    ПРОДАТЬ: 665

    20 ускорения умений
    45 скорости передвижения
  • Дает 12 ускорения заклинаний призывателя.

    ''Эта вещь посвящена победе Ионии над Ноксусом в матче-реванше за Южные провинции 10 декабря 20 года эры Лиги''.

  • Манамунэ

    КУПИТЬ: 2900

    ПРОДАТЬ: 2030

    35 силы атаки
    500 маны
    15 ускорения умений
  • Благоговение: дает дополнительную силу атаки в размере 2.5% от максимального запаса маны.
  • Резервуар маны: поражая врага умением или автоатакой, вы поглощаете заряд и получаете 3 дополнительной маны. Если цель – чемпион, бонус удваивается. Когда вы накапливаете 360 маны с помощью Резервуара маны, этот предмет превращается в Мурамана.

    Вы получаете новый заряд Резервуара маны раз в 8 сек. (максимум зарядов – 4).

  • Испытание Стерака

    КУПИТЬ: 3100

    ПРОДАТЬ: 2170

    50 силы атаки
    400 здоровья
  • Жажда крови: при нанесении урона чемпиону или получении урона от него вы получаете заряд, который восстанавливает (2% от максимального запаса здоровья | 1.2% от максимального запаса здоровья для чемпионов дальнего боя) в течение 6 сек. Эффективность лечения от всех зарядов после первого уменьшена на 50%.
  • Линия жизни: при получении урона, после которого ваш уровень здоровья опускается ниже 30%, вы получаете щит прочностью 100 (увеличивается на (8% от максимального запаса здоровья | 4.8% от максимального запаса здоровья для чемпионов дальнего боя) за каждый заряд Жажды крови) на 4 сек. (перезарядка – 60 сек.).

    Максимум зарядов Жажды крови – 5; по 1 за чемпиона. Прибавки к эффективности лечения и прочности щитов уменьшены до 60% для чемпионов дальнего боя.

  • Сборщик долгов

    КУПИТЬ: 3000

    ПРОДАТЬ: 2100

    55 силы атаки
    20% шанса критического удара
    12 смертоносности
  • Последний долг: если вы наносите вражескому чемпиону урон, после которого у него остается менее 5% здоровья, он погибает. Убийства чемпионов дополнительно приносят 25 золота.
  • Облачение духов

    КУПИТЬ: 2900

    ПРОДАТЬ: 2030

    450 здоровья
    40 сопротивления магии
    10 ускорения умений
    100% базового восстановления здоровья
  • Живительная сила: увеличивает эффективность всего получаемого вами лечения и прочность накладываемых на вас щитов на 25%.
  • Эликсир гнева

    КУПИТЬ: 500

    ПРОДАТЬ: 200

    Активно – поглощение: вы выпиваете эликсир, на 3 мин. получая 30 силы атаки и 15% физического вытягивания жизни (против чемпионов).

    Если вы выпиваете другой эликсир, действие этого прекращается.


    "Приманка'' – рассказ о Каине из Одиссеи

    YouTube | ru | 17 августа 2021 в 16:00

    Кинематографический ролик “Освобождение”: https://bit.ly/3CQ6JEx Кинематографический ролик “Ночь на постоялом дворе”: https://bit.ly/2W4lfY0 Смотрите финал Континентальной лиги 4 сентября: https://bit.ly/3sqRbSx Обзор умений Акшана, Своевольного

    YouTube | ru | 10 августа 2021 в 19:13

    С обновлением середины сезона в игре появились новые механики и особенности. Из этого видео вы узнаете об одной из них — классе канониров. #tft #teamfighttactics #reckoning #dawnofheroes #противостояние #времягероев

    YouTube | ru | 03 августа 2021 в 02:40

    Неожиданные союзники, негодяи и секреты — вот краткий перечень того, что произошло в третьей главе. (Содержит спойлеры к Главе III.) Узнайте завершение истории "Возрождения Стражей" — Глава IV уже вышла.

    YouTube | ru | 03 августа 2021 в 02:36

    Судьба сплела две души воедино. Цена свободы одной — это жизнь другой. Дойдите до конца в "Возрождении стражей" — сюжетном внутриигровом приключении, которое продлится с 8 июля по 11 августа. Видеоролик создан совместно с Axis Studios:

    YouTube | ru | 30 июля 2021 в 18:00

    Отправляйтесь в новое приключение вместе с кротом, фувой и теневиком в "Расплате: Время героев". Путешествуйте по новым аренам, используйте новые бумы и играйте вместе с друзьями, чтобы стать героями собственной истории. Ролик создан в

    YouTube | ru | 30 июля 2021 в 15:42

    Вместо сумрачных предметов появились лучезарные, и это не все изменения. Узнайте подробности о Божественном благословении и новых эмблемах особенностей в этом тактическом разборе.

    YouTube | ru | 27 июля 2021 в 18:00

    Сегодня в программе Ковбойского салуна — особое представление от бесстрашного братства и их друзей. Заказывайте напиток, устраивайтесь поудобнее и наслаждайтесь музыкой барда. Вся выпивка за счет заведения! Регистрация и загрузка Teamfight Tactics:

    YouTube | ru | 23 июля 2021 в 18:00

    Бесстрашное братство отправляется в салун ковбоя каракатца, чтобы прогнать остатки сил тьмы. Это нелегкая задача, но наши герои готовы идти до конца! Регистрация и загрузка Teamfight Tactics: https://teamfighttactics.leagueoflegends.com/ru-ru/

    YouTube | ru | 22 июля 2021 в 23:00

    Легенды, Сущности и артефакты — вот краткий перечень того, что произошло во второй главе. (Содержит спойлеры к Главе II.) Продолжайте историю "Возрождение Стражей" — Глава III уже вышла.

    YouTube | ru | 22 июля 2021 в 18:00

    Если нужно отомстить, зовите Акшана.

    Грозные волны - Страница 15

    Когда язык касается его кожи, Шида судорожно вздрагивает, дергая головой, насколько позволяет хватка демоницы на затылке. Гибрид зажмуривается, извиваясь, пытаясь отпихнуть от себя Эффрехейа, издав жалобный сипящий звук, насколько позволяет его покалеченное горло. Боль слишком слаба, чтоб тревожить его, больше мужчину донимает невероятная, мучительная влажная щекотка, которую причиняет язык Кошмара. Над ухом раздается низкий, рычащий голос и жнецу приходится покорно распахнуть веки, жалобно уставившись на демоницу. Мучительный ужас наполняет его до краев, и, впрямь, словно по приказу Эффрехейа, выливается наружу слезами, солеными дорожками текущими по щекам гибрида. Каин позволяет себе лишь моргать, да, всего на доли секунды, зажмуриться, когда они падают - рефлекторно, а не намеренно. Лишиться глаз - очень больно и страшно, чемпион Полей знает это по личному опыту.

    Влажный язык продолжает скользить по лицу и, не выдержав, Шида вновь дергается, потеряв контроль. Пустив в ход вторую, свободную руку и вцепившись когтями в морду Кошмара, пытаясь отстранить ее от себя. Безуспешно - рука тут-же оказывается перехвачена и прижата, лишая мужчину последней возможности к сопротивлению и Каин, изогнувшись, насколько позволяет хватка, заходится в почти беззвучном, сипящем крике, полностью потеряв контроль над собой. Терпеть то, что с ним делает Эффрехейа непривычно до одури, до дрожи и шока, и потому - страшно и невыносимо. Боль лишь оказывает жнецу услугу, как единственное знакомое ощущение, позволяя ему оставаться в сознании, а не отключиться от животного, всепоглощающего ужаса окончательно. Каин бьется под Эффрехейа и почти беззвучно рыдает от ощущений, которые она ему причиняет.
    Ведь бедный жнец даже не знает таких слов как: "Приятно" и "Удовольствие". Ну как - не знает... Он слышал их и не раз, перед тем, как другой чемпион - похотливая демоница Эвелинн с Полей Правосудия очаровывала его своей магией, застав врасплох. А после - вцеплялась в него острыми когтями и хлыстообразными, острыми, как бритва, хвостами, разрывая его плоть на части.
    Но эти ощущения, которые сейчас причиняла ему Эффрехейа, насильно, жестко, беспощадно, были иными. Шида поймал себя на пронесшейся вскользь мысли, когда, смирившись и обессилев, обмяк под чарами и движениями тела Кошмара, что ему даже нравится то, что она с ним делает. Причем нравится невероятно, до мучительной, сладкой, парализующей дрожи. А потом, в какой-то момент, словно сплетенное заклинание, это удовольствие, собравшееся тугим комом в теле, в особенности - в низу живота, разрядилось, заставив гибрид изогнуться дугой назад и вновь беззвучно, протяжно, сладко закричать.
    И остаться лежать на полу, размазанным, уничтоженным, обессиленным комком дрожащей плоти. Прикосновение языка к щеке ощущается глухо - сил Шида хватает только на то, чтоб тяжело, прерывисто, часто дышать, пытаясь не потерять сознание от горячей волны... чего-то, которая только что прокатилась по его телу. Фраза Кошмара звучит как сквозь слой ваты, а после Эффрехейа оставляет его одного. Кое-как отдышавшись, жнец переворачивается на бок и одними ногами скидывает с себя сапоги, вдогонку к лежащим тут-же штанам. Да, тяжело дыша и не успевая сглатывать слюну, тонкой струйкой текущую из уголка приоткрытого рта на пол, закрывает глаза. В ушах все-еще звенит, а голова кружится. Легкая, чуть саднящая боль от многочисленных царапин и укусов совершенно не донимает гибрид, напротив - она помогает ему быстрее прийти в себя. Сглотнув, Каин медленно приподнимается на локте и вытирает влажные губы и лицо тыльной стороной ладони, стирая слюну и свою густую, черную кровь. Слизывает оную, а после повторяет движение, умываясь таким нехитрым образом, словно кот.
    В голове, меж тем, постепенно проясняется, по мере того, как Шида продолжает сосредоточенно вылизываться. Эхом звучит в ушах фраза Кошмара, заставляя мужчину слабо, вымученно улыбнуться.
    -"Мне понравилось... это было странно и страшно.... но потом стало хорошо... я бы хотел повторить это... но не сейчас... Я очень устал." - сбивчиво, отрывисто раздается мыслеречь Шида. Гибрид знает, что она найдет своего адресата. И, закончив слизывать с себя кровь, ложится на бок и сворачивается в клубок, закрыв глаза и начиная впитывать окружающую тьму. Да так и засыпает. Сон не нужен Каину, но привычен, как самое приятное времяпровождение, возможность ненадолго сбежать из плена на Полях и из реальности. Правда, с Полей Правосудия он уже сбежал...
    С этими, умиротворенными и сладостными мыслями, мужчина засыпает. Пережитый опыт не заставил его бояться Эффрехейа, напротив - теперь Шида ощущает к ней странную, сильную привязанность, как к Мастеру Зеду, но иного толка. И то, что ее присутствие мерещится гибриду во мраке комнаты, не пугает его, а напротив - успокаивает. Жнецу хочется быть рядом с ней. Но не сейчас. Позже. Сейчас он немного поспит...

    League of legends kain - Вэб-шпаргалка для интернет предпринимателей!

    MOBAFire is a community that lives to help every LoL player take their game to the next level by having open access to all our tools and resources. Please consider supporting us by whitelisting us in your ad blocker!

    Want to support MOBAFire with an ad-free experience? You can support us ad-free for less than $1 a month!

    You must be logged in or register before you can
    cast your vote.

    You may also Sign In using your Social Media.

    Please verify that you are not a bot to cast your vote.

    Thanks for your feedback.

    We take these reports seriously
    and will look into it soon.

    We see you are


    running AdBlock.

    MOBAFire is free and advertising
    supported. Please consider whitelisting us
    or signing up for MFN Prime.

    Champion guides for the League of Legends champion Kayn. Created and rated by players, search through some of the best builds to increase your game and dominate the field of battle. Players guide you through every step of Kayn creation, modification and play style. League of Legends guides are sorted by how up to date they are, but can also be sorted by other criteria such as rating, author level, age or total comments. Browse other League of Legends Champion Guides.

    Искусный адепт смертоносной магии тени, Шида Каин стремится однажды выполнить свое предназначение и возглавить Орден тени, положив начало эпохе ионийского превосходства. Каин владеет живым оружием, даркином Раастом, ни на секунду не прекращая борьбу со скверной, которая пытается захватить его разум и тело. Победитель в этой борьбе может быть лишь один: либо Каин укротит клинок. либо злобное оружие поглотит его полностью, и Рунтерра будет обречена.

    Чрезвычайно быстрая скорость фарма, что позволит быстрее фармить и получать много опыта;

    Тип1 lvl18 lvl
    Здоровье5852030
    Регенерация здоровья820.8
    Мана4101260
    Регенерация маны11.527.7
    Броня3894.1
    Магическая защита32.153.4
    Урон68124.1
    Дальность атаки175175
    Скорость атаки0.6250.912
    Скорость передвижения340340

    Описание умений

    В процессе изучения гайда на Каина лучше всего остановиться на изучении способностей героя.

    Первый скилл – пассивное умения The Darkin Scythe, которое обладает достаточно интересным геймплеем. Так, после нанесения удара чемпион накапливает один заряд пассивки. Для опытных игроков в Лигу способность вполне схожа с принципом действия Треша. Так, Треш накапливает души врагов, когда Каин собирает души как с ближников, так и с героев дальнего боя. Суть данного накопления – это переход на новую форму. После перехода на новый уровень герой получает некоторые улучшения не только стиля игры, но и способностей. Более того, после перехода на новую форму игроку будет предоставлена возможность выбора. К примеру, после выбора Сумеречного убийцы дополнительным бонусом от героя станет прибавка к магическому урону в начале боя. Данный бонус можно повторно активировать, если выйти из боя на 8 секунд. Кроме того, способность можно перезарядить если применить ульт. Форма Даркина позволит включить эффективную регенерацию здоровья, что довольно полезно в насыщенном бою. Так или иначе, первая форма позволяет повысить боеспособность чемпиона, когда лечение можно применять для лечения союзников. Для корректного использования скилла требуется после накопления душ активировать соответствующую функцию. И тогда, героя будет трансформирован в новое существо.

    Главным боевым скиллом, который будет описан ниже в гайде на Каина является Reaping Slash. Способность позволяет ударить два раза: в начале и в конце прыжка. Примечательно, что оба этих броска наносят солидный АоЕ урон. Первое применение этого скилла – это быстрая зачистка леса, или же эффективное противостояние противнику в командном бою. К слову, используется скилл не только для убийства, но и для быстрого перемещения героя в особо проблемных участках. Из-за сравнительно низкой перезарядки скилла, а в случае использование некоторых предметов на снижение кулдауна можно довести показатель перезарядки до 3 секунд. Мобильность – основополагающее свойство данного героя. Без сомнения, скилл Shadow Step подходит намного лучше. Впрочем, особо опасные ситуации предполагают использование скилла, ведь быстро перепрыгнуть через препятствие и убежать от погони – лучший выход. В случае, когда форма Даркина более предпочтительна можно получить огромный прирост к урону, который, к слову, будет зависеть от показателей максимального здоровья противника.

    Способность Blade’s Reach в гайде на Каине имеет довольно приоритетное значение. Принцип работы заключается в нанесении довольно мощного урона группе врагов. Примечательно, что неприятная задержка перед использованием не позволит моментально нанести урон. Впрочем, немного игровой практики и к этому можно будет очень быстро привыкнуть. Запомните, что от способности можно довольно просто увернутся, поэтому следует применять ее внимательно. Героя не обременен дополнительными скиллами на контроль, поэтому Balde’s Reach позволит лишь ненадолго замедлить противника. Скорость перезарядки скилла достаточно не велика, впрочем, ее можно всегда уменьшить с помощью специальных артефактов. В хороших условиях и идеальном применении комбинации Blade’s Reach + Reaping Slash можно практически моментально убить вражеского саппорта или мага. Улучшенный скилл под действием формы позволяет применять скилл на ходу, то есть можно настичь врага практически молниеносно. Кроме возможности использовать на ходу можно повысить как урон, так и замедление от способности. В режиме Даркина скилл также сможет дополнительно контролить врага. Довольно схожий по принципу скилл имеет Сион.

    Следующий скилл является самым в главным в данном гайде на Каина. Именно Shadow Step является основным скиллом, дающим крайне высокий показатель мобильности и выживаемости. После активации умения герой получает возможность передвигаться через станы. Дополнительные 5 секунд нахождения в стене помогут внезапно атаковать врага с помощью вышеуказанных способностей. Некоторая казуальность скилла заключается в обозначении потенциального места выхода из-под стены. В основном, скилл подходит для быстрого перемещения по карте и внезапного нападения. В первое время, без сомнения, будет довольно сложно, впрочем, ко всему можно привыкнуть. Конечно, длительность перезарядки довольно высока, но редкие айтемы на уменьшение кулдауна очень сильно помогут.

    Ультимативной способностью Каина является Umbral Trespass – главное средство против вражеского контроля. Принцип действия скилла заключается в переселении души героя в противника. К слову, можно заранее покинуть тело врага, при этом, нанести солидный урон. Посредством использования Сумеречного убийцы можно также применять пассивку два раза. К примеру, вступаем в бой и применяем ультимативную способность, после, можно повторно применить скилл на урон. Дополнительно повышается дальность скилла, что не может не радовать. Перед использование ульта сначала потребуется отметить врага, в которого нужно вселиться. После, атаковать противника и тогда уже применить скилл. В воплощении Даркина прибавка к урону будет огромна, кроме того, можно будет получить дополнительное здоровье, которое будет зависеть от максимального показателя здоровья цели. К примеру, после вселения в довольно плотного врага можно получить хороший процент восстановленного здоровья. Так или иначе, использование скилла может довольно кардинально изменить ход поединка.

    Билд на Каина лесника (Jungler)

    Выбор заклинаний:

    Следующий блок гайда на Каина в 2018 посвящен описанию наиболее полезных для героя заклинаний.

    Поскольку герой довольно зависим от фарма, пригодится Smite. Хорошим дополнительным заклинанием станет Flash, впрочем, учитывая скорость и мобильность чемпиона – более целесообразным станет Ignite. Последний вариант очень хорош для буста урона в особенности против толстых врагов со способностями на лечение.

    Прокачка способностей:

    Ход прокачки заключается в приоритетном улучшении способности Reaping Slash. Данное действие позволит намного быстрее фармить, в особенности на начальном этапе игры. После, прокачивается главный источник урона – Blade’s Reach. Скилл Shadow Step лучше всего прокачать на первый уровень, поскольку лишняя возможность убежать никогда не помешает. Ультимативная способность прокачивается на 6 и по мере доступности.

    14579
    28101213
    314151718
    61116

    Своеобразным отклонением от нормы станет второй вариант прокачки. Суть которого, заключается в следующем. На первом уровне и дальше отдаем приоритет скиллу Blade’s Reach, при этом, обязательно прокачиваем Reaping Slash. Главным условием данного варианта прокачки является использование формы Даркина и получения хорошего буста от прокаченных скиллов. Так или иначе, вариаций прокачки настолько много, что экспериментировать можно бесконечно.

    Артефакты и особенности выбора.

    Начальный закуп.

    Для обеспечения комфортного фарма леса можно приобрести Hunter’s Talisman, который является довольно универсальным выбором. Иные начальные артефакты должны быть рассчитаны на прибавку к восстановлению здоровья. Отлично подойдет Refillable Potion или же Health Potion. Следующие айтемы для улучшения – это Stalker’s Blade или Skirmisher’s Sabre, которые обеспечат хорошую прибавку к длительности замедления. В случае, когда силы союзных саппортов позволяют хорошо контролировать врага можно остановиться на обычной сабле дуэлиста. Благодаря подобному выбору можно обеспечить солидный прирост к урону. В плане выбора зачарований лучше всего подойдет Warrior.

    Основные артефакты

    Как уже было указано в данном гайде на Каина, герой отличается тем, что имеет две формы. Следовательно, количество доступных и подходящий айтемов довольно велико. Наиболее частым выбором является The Black Cleaver и Duskblade of Drajtharr. Первый вариант действительно приобретается фактически каждую битву, когда Ддактарра довольно ситуативный выбор. Во-первых, форма Сумеречного убийцы позволит показывать намного больший урон, хорошими артефактами для формы являются: Duskblade of Draktharr, Youmuu’s Ghostblade, Edge of Night и Death’s Dance. В плане защитных айтемов пригодится Guardian Angel. В случае использования второй формы лучше всего пригодятся айтемы на прибавку к защитным характеристикам. Лучше всего подойдут: Dead Man’s Plate, Spirit Visage и Guardian Angel.

    Окончательный закуп

    Данный выбор подходит для формы Даркина, а также тогда, когда требуется выдержать максимальное количество урон. Так или иначе, всегда можно заменить защитный артефакт на айтем на дополнительный урон. Лучшим выбором для ситуации станут сапоги Mercury’s Treads, которые дадут хорошее сопротивление к магическому урону.

    В случае игры за форму Сумеречного убийцы, само собой, следует использовать айтемы на урон. Дополнительно можно использовать Death’s Dance или Edge of Night. Но только тогда, когда присутствует полная уверенность в том, что вражеские чемпионы не смогут быстро убить Вас.

    Плюсы и минусы Каина

    Преимущества:
    • Чрезвычайно быстрая скорость фарма, что позволит быстрее фармить и получать много опыта;
    • Высокий урон от направленных способностей;
    • Достаточно быстрый и мобильный герой, который получает данные характеристики посредством использования способностей;
    • Способность бесплотности обеспечит полную уверенность в быстром побеге или же внезапном нападении. Кроме того, возможность проходить через стену обеспечит эффективное прохождение через карту без попадания на вражеский вижин;
    • Гибкость и эффективность героя обеспечивается за счет наличия двух активных форм. Так, по ходу катки можно спокойно подстраиваться под той или иной стиль игры;
    • Довольно нестандартный способ и стиль игры.

    Отрицательные стороны:
    • Отсутствие хороших способностей на контроль. Поэтому, лучше всего подобрать довольно мощных союзников-саппортов;
    • Запомните, чтобы увеличить силу героя следует как можно быстрее выбрать нужную форму. Делать это можно только один раз за катку;
    • Форма убийцы предполагает довольно низкие показатели защитных характеристик. Единственным плюсом является скорость передвижения;
    • Довольно низкие начальные характеристики;
    • Чемпион будет довольно сложным для освоения.

    Опасные враги

    Как было указано в гайде на Каина по League of Legends, игра за Каина очень сложна, хоть и предполагает то, что чемпион довольно силен. Герой не только быстр и силе, но и достаточно гибкий. Примечательно, что на начальном этапе игры будет очень сложно против толстых героев. Довольно схожие по принципу герои это: Maokai, Sejuani и Volibear. Также, опасными противниками станут Shaco и Evelynn, которые могут подстеречь чемпиона именно там. Следует быть предельно внимательным именно в процессе фарма.

    Союзники

    Хорошей помощью в схватке станут герои, ориентированы на способности на контроль. Идеальным вариантом для игры станет случай, когда все линии будут обеспечены хорошей поддержкой со стороны героев на контроль.

    Полезные советы

    Как уже было указано в данном гайде на Каина, герой обладает двумя активными формами. Использовать которые, следует осторожно и зависимо от ситуации. Для начала лучше всего выбрать более танковую форму Даркина, которая обеспечит отличную защиту, при этом, хорошее восстановление здоровья после использования способностей. Кроме того, улучшенный скилл Blade’s Reach обеспечит то нужное подбрасывание, которое обеспечит дополнительный контроль в бою. Примечательно, что кастовать способность можно прямо во время использования Shadow Step. В результате, можно добиться быстрого и гарантированного применения подбрасывания. Хорошая комбинация. В форме восстановления здоровья можно опять же-таки перевернуть ход битвы, путем использования ульты.

    Гайд на Каина через лес предполагает использование хороших способностей на урон по области. Запомните, что фармить следует с очень полезного кэмпа остроклювов, которые не только будут быстро убиты, но и не успеют нанести довольно большой урон. После убийства этих крипов можно сразу переходить к фарму красного улучшения. После, можно будет получить хорошую награду. Следует понимать, что фармить лес требуется до тех пор, пока количество прокаченных скиллов не позволит выйти на ганг. Призрачную поступь рекомендуется применять практически по откату, это, в свою очередь, позволит очень эффективно перемещаться по карте и ускорить фарм. Перед началом ганга обдумайте все возможные сценарии развития битвы. Так, предварительно согласуйте некоторые моменты с союзниками, чтобы гарантировано получить килл. После, можно атаковать прямо со спины.

    Первые ганги лучше всего осуществлять после получения нескольких уровней. Так, дополнительно требуется сходить на базу и закупиться хорошими ранними айтемами. Преследуйте одну лишь цель – быстрый и экономящий время фарм, тогда, столь нужные артефакты появятся довольно рано. Совершать ганг рекомендуется непосредственно в ходе фарма, то есть требуется параллельно фармить нейтралов и планировать ближайшее посещение линии. Перед совершением атаки также дополнительно продумайте возможные позиции вражеских вардов. Поэтому, лучше всего совершать нападение, соблюдая вышеуказанные принципы. Примечательно, что для обеспечения полноценности героя рекомендуется использовать ганги, которые позволят получить нужные заряды. Чтобы в дальнейшем, приобрести другую форму. В противном случае, когда мобильность и защита врагов не позволяет этого сделать, можно спокойно продолжить дальнейший фарм.

    Мид гейм за чемпиона отличается тем, что герой получает возможность принять нужную форму. В большинстве случаев это – 8 или 11 уровень. Следовательно, польза от чемпиона будет огромна, а сила его способностей возрастет многократно. Тогда, роль героя значительно преображается и заключается в постоянном ганге соседних линий с параллельным фармом лесных нейтралов. Ни в коем случае не следует затягивать катку, поскольку эффективность героя наблюдается именно на этом этапе. Также, в ходе ганга старайтесь обеспечивать полноценностью каждое посещение линии. Хорошим вариантом будет своевременное убийство сильных нейтралов.

    В лейт гейме в гайде на Каина будут указаны основные особенности героя в данном этапе.

    Функции и приоритеты в конце катки значительно другие. Командная игра – это наше все, поскольку именно в слаженных действиях команды кроется суть победы. По правде говоря, эффективность героя будет падать, а в случае выбор формы убийцы могут наблюдаться некоторые проблемы с выживаемостью. Основной задачей в бою по-прежнему остается убийство наиболее слабых в плане защиты керри-героев врага. После выбора Даркина главная роль Каина будет заключаться в принятие на себя части урона. А также, в обеспечении показательного урона по области. А после наступления критической ситуации в битве, можно спокойно использовать ультимативную способность и восстановить здоровье.

    Так или иначе, Каин довольно любопытный и необычный выбор. Впрочем, для получения максимальной эффективности требуется довольно много опыта в игре. От игрока требуется не только быстрота реакции, но и хорошие способности к анализу игры. Так, неверная форма приведет к тому, что игра может быть приведена к поражению.

    Рекомендуем к прочтению

    Каин: путь теней - Coub

    Каин: путь теней - Coub - The Biggest Video Meme Platform
    • Home
    • Hot
    • Random
    • Show more...

      Show less

    • My likes
    • Bookmarks
    • Communities
    • Animals & Pets

    • Blogging

    • Stand-up & Jokes

    • Mashup

    • Anime

    • Movies & TV

    • Gaming

    • Cartoons

    • Art & Design

    • Live Pictures

    • Music

    • News & Politics

    • Sports

    • Science & Technology

    • Food & Kitchen

    • Celebrity

    • Nature & Travel

    • Fashion & Beauty

    • Dance

    • Auto & Technique

    • Memes

    • NSFW

    • Featured

    • Coub of the Day

    • Dark Theme

    (PDF) Огава К., Паскуалини Р., Линдберг Р.А., Каин Р., Фриман А.Л., Паскуале Е.Б. Лиганд эфрина-A1 и его рецептор, EphA2, экспрессируются во время неоваскуляризации опухоли. Онкоген 19: 6043-6052

    Bobik A, Agrotis A и Little PJ. (1997). Опухоль

    Ангиогенез. Бикнесс, Р. (редактор). OxfordUniversityPress:

    Нью-Йорк, стр. 169 ± 184.

    Брукс П.С., Кларк Р.А. и Череш Д.А. (1994). Science, 264,

    569 ± 571.

    Daniel TO, Sein E, Cerretti DP, St John PL, Robert B и

    Abrahamson DR (1996) Kidney Int.(Прил.) 57, S73 ±

    S81.

    Дэви А., Гейл М.В., Мюррей Е.В., Клингхогер Р.А., Сориано П.,

    Фейерштейн С. и Роббинс С.М. (1999). Genes Dev., 13,

    3125 ± 3135.

    Dodelet VC и Pasquale EB. (2000). Онко-ген (в печати).

    Исти DJ, Херлин М. и Беннетт, округ Колумбия. (1995). Int. J. Cancer,

    60, 129 ± 136.

    Easty DJ, Hill SP, Hsu MY, Fallow®eld ME, Florenes VA,

    Herlyn M and Bennett DC. (1999). Int. J. Cancer, 84,

    494 ± 501.

    Eberhart J, Swar tz M, Koblar S. A, Pasquale E B, Tanaka H

    и Krull CE. (2000). Dev. Neurosci., 22, 237 ± 250.

    Eph-Nomenclature-Committee. (1997). Cell, 90, 403 ± 404.

    Flanagan JG и Vanderhaeghen P. (1998). Анну. Rev.

    Neurosci., 21, 309 ± 345.

    Flenniken AM, Gale NW, Yancopoulos GD и Wilkinson

    DG. (1996). Dev. Биол., 179, 382 ± 401.

    Folkman J. (1995). Nature Med., 1, 27 ± 31.

    Фолкман Дж. И Д'Амор, штат Пенсильвания.(1996). Cell, 87, 1153 ± 1155.

    Fox SB, Turner GD, Gatter KC and Harris AL. (1995). J.

    Pathol., 177, 369 ± 376.

    Friedlander M, Brooks PC, Shaer RW, Kincaid CM,

    Varner JA и Cheresh DA. (1995). Sci ence, 270, 1500 ±

    1502.

    Gale NW и Yancopoulos GD. (1999). Genes Dev., 13,

    1055 ± 1066.

    Gasparini G. (1997). Опухоль Гиогенез. Бикнелл, Р.

    (ред.). Oxford University Press: Нью-Йорк, стр.29 ± 43.

    Герети С.С., Ван Х.Ю., Чен Ц.Ф. и Андерсон Д.Д. (1999).

    Мол. Cell., 4, 403 ± 414.

    Hanahan D. (1997). Наука, 277, 48 ± 50.

    Ханахан Д. и Фолкман Дж. (199 6). Cell, 86, 353 ± 364.

    HerndierBG, WernerA, ArnsteinP, AbbeyNW, Demartis

    F, Cohen RL, Shuman MA и Levy JA. (1994). AIDS, 8,

    575 ± 581.

    Hirai H, Maru Y, Hagiwara K, Ni shida J и Takaku F.

    (1987). Наука, 238, 1717 ± 1720.

    Holash JA и Pasquale EB. (1995). Dev. Biol., 172, 683 ±

    693.

    Holzman LB, Marks RM, Dixit VM. (1990). Мол. Клетка.

    Biol., 10, 5830 ± 5838.

    Huynh-Do U, Stein E, L ane AA, Liu H, Cerretti DP и

    Daniel TO. (1999). EMBO J., 18, 2165 ± 2173.

    Kalo MS и Pasquale EB. (199 9). Cell Tissue Res., 298, 1 ±

    9.

    KiyokawaE, TakaiS, TanakaM, IwaseT, SuzukiM, Xiang

    YY, Naito Y, Yamada K, Sugimura H и Kino I.(1994).

    Cancer Res., 54, 3645 ± 3650.

    Линдберг Р.А. и Хантер Т. (1990). Мол. Клетка. Biol., 10,

    6316 ± 6324.

    Magal E, Holash JA, Toso RJ, Chang D, Lindberg RA и

    Pasquale EB. (1996). J. Neurosci. Res., 43, 735 ± 74 4.

    Мару Й., Хираи Х. и Такаку Ф. (1990). Онкоген, 5, 445 ±

    447.

    Maru Y, Hirai H, Yoshida MC и Taka ku F. (1998). Мол.

    Ячейка. Biol., 8, 3 770 ± 37 76.

    McBride JL и Ruiz JC.(1998). Мех. Dev., 77, 201 ± 204.

    Mellitzer G, Xu QL и Wilkinson DG. (1999). Nature, 400,

    77 ± 81.

    Merenmies J, Parada LF и Henkeme yer M. (1997). Cell

    Growth Dier., 8, 3 ± 10.

    Miao H, Burnett E, Kinch M, Simon E and Wang BC.

    (2000). Nature Cell Biol., 2, 62-69.

    Пандей А., Шао Х., Маркс Р.М., Полверини П.Дж. и Диксит В.М.

    (1995). Science, 268, 567 ± 569.

    Паскуалини Р., Койвунен Э. и Руослахти Э.(1997). Nat.

    Biotechnol., 15, 542 ± 546.

    Price JE, Polyzos A, Zhang RD и Daniels LM. (1990).

    Cancer Res., 50, 717 ± 721.

    Risau W. (1997). Nature, 386, 671 ± 674.

    Risau Wand Flamme I. (1995). Анну. Rev. Cell. Dev. Биол.,

    11, 73 ± 91.

    Sarma V, W olf FW, Marks RM, показывает TB и Dixit VM.

    (1992). J. Immuno l., 148, 33 02 ± 331 2.

    Sato TN, T ozawa Y, Deutsch U, Wolburg-Buchholz K,

    Fujiwara Y, G endron-Maguire M, Gridley T, Wolburg H,

    RisauWandQinY.(1995). Nature, 376, 70-74.

    Soans C., Holash JA и Pasquale EB. (1994). Онкоген, 9,

    3353 ± 3361.

    Соанс С., Холаш Дж. А., Павлова Ю. и Паскуале Е.Б. (1996). J.

    Cell Biol., 135, 781 ± 795.

    Stein E, Lane AA, Cerretti DP, Schoecklmann HO, Schro

    AD, Ven Etten RL и Da niel TO. (1998). Genes Dev., 12,

    667 ± 678.

    Сури С., Джонс П.Ф., Патан С., Бартункова С., Maisonpierre PC,

    Дэвис С., Сато Т.Н. и Янкопулос Г.Д.(1996). Cell, 87,

    1171 ± 1180.

    Такахаши Х. и Икеда Т. (1995). Онкоген, 11, 879 ± 883.

    van der Geer P, Hunter T. и Lindberg RA. (1994). Анну.

    Rev. Cell Biol., 10, 251 ± 337.

    Walker-Daniels J, Coman K, Azimi M, Rhim JS, Bostwick

    DG, Snyder P, Kerns BJ, Waters DJ и Kinch MS.

    (1999). Prostate, 41, 275 ± 280.

    Wang HU, Chen Z F и Anderson DJ. (1998). Cell, 93,

    741 ± 753.

    Xu Q, Mellitzer G, Robinson V и Wilkinson DG.(1999).

    Nature, 399, 267 ± 271.

    Zisch AH, Paz zagli C., Freeman AL, Schneller M, Hadman

    M, Smith JW, Ruoslahti E and Pasquale EB. (2000).

    Онкоген, 19, 177 ± 187.

    UICC. (1997). Международный союз против рака: TNM,

    Классификация злокачественных опухолей. 5 изд. (eds) Собин

    LH и Виттекинд C. J Wiley & Sons, Inc.

    Эфрин-A1 и EphA2 в васкуляризации опухоли

    К. Огава и др.

    6052

    Онкоген

    Нейтрофильная внеклеточная ловушка связана с образованием внеклеточной ловушки. передача сигналов при ANCA-ассоциированном васкулите

    Clin Exp Immunol.2015 июн; 180 (3): 408–418.

    , *, 1 , *, 1 , * , * , * , * , * , , 235, * * , , , и *

    S Tang

    * Кафедра нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037270, Китай 9000 Чжан

    * Отделение нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    ЮВ Инь

    * Отделение нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    XJ Gao

    * Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    WW Shi

    * Отделение нефрологии госпиталя Синьцяо, Третье Военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    Y Wang

    * Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    X Хуан

    * Отделение нефрологии госпиталя Синьцяо , Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    L Wang

    Институт иммунологии НОАК, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

    LY Zou

    Институт иммунологии НОАК , Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

    JH Zhao

    * Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    YJ Huang

    * Отделение нефрологии Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    LY Shan

    Кафедра иммунологии, медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

    AS Gounni

    Кафедра иммунологии, Медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

    YZ Wu

    Институт иммунологии PLA, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

    JB Zhang

    * Кафедра нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    * Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

    Институт иммунологии НОАК, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

    Отделение Иммунология, медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

    Для переписки: Дж.-B. Чжан, отделение нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин 400037, Китай. Эл. Почта: [email protected]

    1 Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

    Авторские права © 2015 Британское общество иммунологииЭта статья цитируется в других статьях в PMC.

    Abstract

    Все больше данных указывает на то, что аберрантное образование внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET) может вносить вклад в патогенез васкулита (AAV), ассоциированного с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA).Недавние исследования предоставили доказательства того, что новый тип аутоантитела ANCA, антитело против лизосомного мембранного протеина-2 (LAMP-2), может играть патогенную роль в AAV. Ранее мы показали, что образование NET, стимулированное антителами против LAMP-2, содержит аутоантигены и антимикробные пептиды. Настоящее исследование было направлено на определение того, присутствует ли LAMP-2, как новый антиген ANCA, в NETs у пациентов с AAV, влияние антитела против LAMP-2 на скорость апоптоза нейтрофилов и роль аутофагии в анти-LAMP -2 индуцированное антителами образование NET.Образование NET оценивали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии или визуализации живых клеток. Скорость апоптоза нейтрофилов анализировали с помощью сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS). Аутофагия была обнаружена с помощью накопления LC3B и просвечивающей электронной микроскопии. Результаты показали, что усиленное образование NET, которое содержит LAMP-2, наблюдалось в биоптатах почек и нейтрофилах от пациентов с AAV. Скорость апоптоза значительно снизилась в нейтрофилах человека, стимулированных антителом против LAMP-2, и этот эффект ослабили ингибиторы аутофагии 3-метиладенин (3MA) и 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-он ( LY294002).На образование NET, стимулированное антителами против LAMP-2, не влияли бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетон (zVAD-fmk) и некростатин-1 (Nec-1), которые являются ингибиторами апоптоза и некроза, соответственно. , но подавлялся 3MA и LY294002. Более того, доля LC3BI, который был преобразован в LC3BII, значительно увеличился ( P = 0,0057), и массивные вакуолизации, которые проявляли характеристики, типичные для аутофагии, были обнаружены в нейтрофилах, стимулированных антителом против LAMP-2.Наши результаты предоставляют дополнительные доказательства того, что аутофагия участвует в ANCA-индуцированном образовании NET в нейтрофилах человека.

    Ключевые слова: антинейтрофильные цитоплазматические антитела, апоптоз, аутофагия, внеклеточные ловушки нейтрофилов, васкулит

    Введение

    Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA) -ассоциированные васкулиты (AAV) являются группой аутоиммунных заболеваний. инфильтрация нейтрофилов, накопление непогашенного лейкоцитоклаза в периваскулярных тканях и фибриноидный некроз стенок сосудов 1.У пациентов с ААВ часто наблюдается быстро прогрессирующая почечная недостаточность, вызванная серповидным гломерулонефритом (ГН). Было показано, что миелопероксидаза (MPO) и протеиназа 3 (PR3) являются двумя основными антигенами ANCA 2. Аутоантитело к лизосомному мембранному белку-2 (LAMP-2) представляет собой дополнительный подтип ANCA 3,4.

    ANCA, которые активируют нейтрофилы через фрагменты Fab и Fc, которые прикрепляются к эндотелиальным клеткам и вызывают повреждение, как полагают, играют прямую роль в патогенезе AAV 5. Каин и его коллеги недавно представили доказательства того, что другой тип аутоантител, анти-LAMP-2 (направленный против белка лизосомальной мембраны-2), может иметь патогенную роль в AAV и молекулярную мимикрию между LAMP-2 и белком бактериальной адгезии FimH 4.Однако распространенность аутоантител к LAMP-2 в AAV остается спорной 6,7. Наши предыдущие данные показали, что антитело против LAMP-2 может активировать нейтрофилы in vitro для высвобождения внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET), которые содержат аутоантигены и антимикробные пептиды 8.

    Нейтрофилы являются самой распространенной группой лейкоцитов в кровообращении. , и они имеют очень короткую продолжительность жизни до апоптоза. Нейтрофилы формируют первую линию защиты от вторжения патогенов с несколькими эффекторными механизмами, включая фагоцитоз, высвобождение бактерицидных продуктов и продукцию активных форм кислорода (ROS) 9.Образование NET, также называемое NETosis, представляет собой уникальный, недавно открытый механизм врожденной иммунной защиты, характеризующийся активным высвобождением волокон хроматина, украшенных различными гранулированными белками, во внеклеточное пространство в ответ на бактерии 10. Хотя NET являются бактерицидными и вносят свой вклад в врожденная защита хозяина, чрезмерное образование NET были связаны с патогенезом аутоиммунного заболевания 11. Наши и другие данные продемонстрировали, что NET запускают васкулит и закрепляют аутоиммунный ответ против компонентов нейтрофилов, таких как MPO, PR3 и кателицидин LL37, у пациентов с AAV с 8,12–14 и в моделях на животных 15.

    НЕТоз - это сложный процесс, который различается в зависимости от стимула. Хотя регуляция субклеточных событий во время NETosis остается неясной, все больше данных указывает на то, что продукция супероксида, Raf / митоген внеклеточная сигнально-регулируемая киназа (MEK) / активация внеклеточной сигнальной киназы (ERK), аутофагия и цитруллинирование гистонов могут быть вовлечены в образование NET. 16. Принимая во внимание, что LAMP-2 является критическим для аутофагии 17, мы предположили, что связанная с аутофагией передача сигналов может участвовать в индуцированном антителом LAMP-2 образовании NET.

    Аутофагия является критическим гомеостатическим механизмом, участвующим в очистке поврежденных органелл или белков и в выживании клеток в периоды истощения питательных веществ, и обеспечивает необходимое снабжение питательными веществами за счет рециркуляции цитозольных макромолекул и органелл 18. Передача сигналов PI3K имеет решающее значение для инициации аутофагии. , тогда как слияние ранних аутофагосом с лизосомами и закисление аутофагосом составляет конечное событие в аутофагии. Напротив, ингибирование PI3K с помощью 3-метиладенина (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-она (LY294002), как предполагается, ингибирует аутофагию 19.

    На основании этих результатов мы попытались определить, присутствует ли LAMP-2, как новый ANCA-нацеленный аутоантиген, в NET у пациентов с AAV, и влияние антитела против LAMP-2 на апоптоз нейтрофилов при активации высвобождения NET. Кроме того, мы исследовали роль связанной с аутофагией передачи сигналов в образовании NET, стимулированном антителами против LAMP-2.

    Материалы и методы

    Субъекты

    Пятнадцать пациентов с ААВ, диагностированных в соответствии с определением Чапел-Хилл 20, были набраны из отделения нефрологии госпиталя Синьцяо Третьего военного медицинского университета.Демографические характеристики пациентов с ААВ представлены в таблице. В настоящее исследование были включены периферическая кровь, собранная у этих пациентов и здоровых людей из контрольной группы (HC), а также парафиновые срезы образцов биопсии почек, полученных от шести пациентов с серповидным GN. Все биопсии были рассмотрены и классифицированы опытным нефропатологом на основе пересмотренных критериев серповидного GN. PR3-ANCA и MPO-ANCA оценивали с помощью непрямой иммунофлуоресценции (IIF) (FA-1200-2010; Euroimmun, Singapore) с использованием наборов EUROBlot (DL-1200-6421-3G; Euroimmun) в соответствии с инструкциями производителя.Уровни креатинина (Cr) в сыворотке определяли стандартными методами. Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Синьцяо, и все субъекты предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

    Таблица 1

    Демографические характеристики субъектов исследования.

    Все пациенты с AAV Crescentic + Пациенты с AAV Здоровые контрольные
    Общее количество 15 6 женский пол. 8/7 3/3 4/6
    Возраст, средний (диапазон) лет 48 (7–73) 50 (8–73) 41 (25–57)
    MPO + , номер 11 5 нет данных
    PR3 + , номер 4 1 n.a.
    Cr сыворотки, медиана (диапазон), мкмоль / л 462 · 28 (52 · 0–947 · 3) 610 · 70 (165 · 7–947 · 3) n.а.

    Иммунофлуоресцентный анализ биопсий почек

    Пункционные биопсии почек пациентов с AAV с серповидным GN ( n = 6) фиксировали и заливали парафином. Затем были приготовлены срезы размером 5 мкм и помещены на предметные стекла. После депарафинации с использованием ксилола, регидратации с использованием градиента этанола и извлечения антигена с использованием цитратного буфера мы обрабатывали образцы блокирующим буфером, а затем флуоресцентно меченными антителами против LAMP-2, MPO или PR3 (все из Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Гистон окрашивали с использованием первичных антител против гистона h4 (Abcam, Гонконг, Китай), а затем флуоресцентно меченных специфических вторичных антител. ДНК окрашивали с использованием 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Beyotime, Шанхай, Китай). Эти образцы были проанализированы с помощью конфокального микроскопа Leica SP5.

    Выделение нейтрофилов человека

    Нейтрофилы человека выделяли центрифугированием плотности с использованием Polymorphprep ™ (Axis-Shield, Осло, Норвегия). Вкратце, 5 мл крови, содержащей этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), наслаивали на 5 мл Polymorphprep ™.После 35 мин центрифугирования при 500 rcf нейтрофилы отделяли от осадка, обогащенного полиморфноядерными нейтрофилами (PMN). Затем остаточные эритроциты удаляли посредством лизиса эритроцитов. Чистота нейтрофилов обычно составляла ~ 95%, как оценивали по маркировке CD16 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) с помощью цитометрического анализа. Если не указано иное, клетки ресуспендировали в среде RPMI (без фенолового красного) (не использовалась ни телячья, ни человеческая сыворотка) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина; 5 × 10 5 -10 6 нейтрофилов / мл высевали на культуральные планшеты или стеклянные покровные стекла для иммунофлуоресцентного анализа.Инкубации проводили при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 .

    Иммунофлуоресценция и количественная оценка образования NET

    Нейтрофилы высевали на покрытые лизином предметные стекла в 24-луночных планшетах для культивирования клеток и инкубировали в течение 1 часа для прилипания к покровным стеклам. В экспериментах по стимуляции клетки стимулировали ацетатом форболмиристата (PMA) (100 нМ) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), антителом против LAMP-2 (20 мкг / мл, без азидов) (Abcam ) или изотип-специфическое контрольное антитело (20 мкг / мл, мышиный IgG1 без азидов) (Abcam) на срок до 180 мин.Для экспериментов по ингибированию нейтрофилы предварительно обрабатывали бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетоном (zVAD-fmk) (10 мкМ), некростатином-1 (Nec-1) (10 мкМ), LY294002 (50 мкМ) ( все от Sigma-Aldrich) или 3MA (5 мМ) (InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение 15 мин перед нанесением антитела против LAMP-2. Впоследствии клетки фиксировали и повышали проницаемость. После регидратации физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) при комнатной температуре клетки инкубировали в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° C.Затем образцы инкубировали с меченными флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) антителами против LAMP-2, MPO или PR3. Хроматин окрашивали с использованием кроличьих антител против гистона h4, а затем окрашивали флуоресцентно меченными вторичными антителами козьего против кроличьего иммуноглобулина (Ig) G. ДНК окрашивали с использованием DAPI. Метод количественной оценки образования NET, как сообщалось ранее 12,21. Вкратце, используя объектив × 20, процент высвобождающих нейтрофилы NETs был количественно определен в слепых пробах путем оценки нейтрофилов, демонстрирующих расширенные ядра [ядра без дольчатости и превышающие нормальный средний диаметр окрашивания ДНК (10 мкм)] и высвобождающие волокна ДНК в не менее пяти случайных полей микроскопа.Файлы изображений были проанализированы с помощью программного обеспечения Image pro-Plus версии 6 · 0. Процент NET рассчитывали следующим образом: NET-rate (%) = 100 × количество нейтрофилов, демонстрирующих расширенные ядра и высвобождающих волокна ДНК / общее количество нейтрофилов.

    Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

    Свежеочищенные нейтрофилы стимулировали 20 мкг / мл антитела против LAMP-2 или контрольного антитела изотипа в течение до 3 часов, а затем клетки фиксировали в 2,5% глутаральдегиде в течение 2 часов. при 4 ° C. После трехкратной промывки физиологическим раствором образцы дегидратировали с использованием градуированного этанола с последующей серией трет-бутилового спирта, а затем сушили в сушилке для критической точки.Поверхности образцов покрывали слоем платины / углерода толщиной 5 нм с использованием тонкослойного испарителя.

    Визуализация живых клеток

    Нейтрофилы разбавляли до 2 × 10 6 клеток / мл в культуральной чашке со стеклянным дном для наблюдения живых клеток (NEST, Шанхай, Китай) и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C в присутствии 10 мкг / мл Hoechst 33342 (Beyotime, Шанхай, Китай) и 1 мкМ Sytox green (Invitrogen, Grand Island, NJ, США). Затем клетки обрабатывали антителом против LAMP-2 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 180 мин.Флуоресцентные сигналы были обнаружены и отображены с помощью рабочей станции Leica SP5. Морфологию клеток наблюдали с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК). Клетки контролировали в различные моменты времени, и каждые 3 мин снимали несколько стопок изображений.

    Анализ клеточной сортировки с активацией флуоресценции (FACS)

    Скорость апоптоза нейтрофилов измеряли с помощью проточной цитометрии (BD FACSCantoII) с использованием набора для обнаружения апоптоза Annexin-V / PI (4Abio, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

    Вестерн-блот-анализ

    Вестерн-блот-анализ проводили на клетках, обработанных в течение 30 мин. В этот момент времени наиболее заметное превращение LC3BI в LC3BII наблюдалось после обработки антителом против LAMP-2. Нейтрофилы осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса с добавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), и остатки клеток удаляли центрифугированием после инкубации лизата в течение 30 минут на льду. Затем 30 мкг белка разделяли на геле для электрофореза в 12% додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE).Затем проводили инкубацию в течение ночи мембран поливинилидендифторида (PVDF) при 4 ° C в антителе против LC3B (1: 3000) (Novus, Литтлтон, Колорадо, США) с последующим зондированием вторичным конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). антитело (1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре.

    Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

    После стимуляции нейтрофилы собирали центрифугированием (1500 об / мин в течение 10 мин). Затем осадок клеток фиксировали с использованием 2,5% глутарового альдегида, затем фиксировали с использованием 1% тетроксида осмия, контрастировали уранилацетатом и дубильной кислотой, дегидратировали, заливали в формы, содержащие чистую смолу Спурра, и давали затвердеть при 70 ° C. .После полимеризации образцы были разрезаны на срезы 60 нм и окрашены цитратом свинца.

    Статистический анализ

    Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (s.e.m.). Статистический анализ включал непарный тест Стьюдента t и выполнялся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5. Значения вероятности P <0,05 считались статистически значимыми.

    Результаты

    Отложение NETs в почках пациентов с AAV с серповидным GN

    Чтобы оценить роль NETs в воспалении почек, мы исследовали панель залитых парафином тканевых срезов из биопсии почек от пациентов с AAV с серповидным GN и острым синдромом. ухудшение функции почек ( n = 6).Как и ожидалось, мы обнаружили типичные компоненты NET, которые выглядели как `` облачно '' или `` нитевидные '' окрашенные структуры ДНК и совместную локализацию гистонов и гранулярных белков, таких как MPO (,) и PR3 (,), как сообщалось ранее 12. Мы также обнаружили LAMP-2, новый целевой аутоантиген ANCA, наблюдаемый в NET, расположенных в пораженных клубочках () и в интерстиции () биопсий почек от пациентов с AAV с серповидным GN. Однако только слабые сигналы иммунофлуоресценции, положительные для гистона и МПО, наблюдались в почечных тканях от пациентов с AAV с не серповидным GN (,).Наши результаты предполагают, что отложение NET может вносить вклад в формирование серповидной формы у пациентов с быстро прогрессирующим AAV.

    Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) откладываются в биоптатах почек у пациентов с васкулитом (AAV), ассоциированным с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA). Иммунофлуоресцентный анализ залитых парафином срезов биопсии почек от пациентов с AAV с серповидным гломерулонефритом (GN) или без него. NET идентифицировали по совместной локализации с внеклеточной ДНК (синий), гистонами (красный) и белками нейтрофильных гранул миелопероксидазой (MPO), протеиназой 3 (PR3) или лизосомальным мембранным белком-2 (LAMP-2) (зеленый).(a – c) Совместная локализация аутоантигенов (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в клубочках (обозначенных белой линией). (e – g) Совместная локализация аутоантигенов (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в интерстиции почечных канальцев (обозначена белой линией). (d, h) Совместная локализация MPO (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в срезах биопсии почек от пациентов с AAV без серповидного GN.

    Повышенное образование NET в периферических нейтрофилах у пациентов с AAV

    Kessenbrock et al .12 предположили, что ANCA-индуцированное образование NET участвует в васкулите и хроническом аутоиммунитете у пациентов с AAV. Чтобы оценить образование NET и определить, является ли LAMP-2 совместно локализованным с NET у пациентов с AAV, нейтрофилы периферической крови были изолированы от пациентов с AAV ( n, = 15) и здоровой контрольной группы (HC) ( n = 10), и были затем инкубировали в инкубаторе CO 2 при 37 ° C в течение 1 часа перед обнаружением NET с помощью флуоресцентной визуализации. Мы обнаружили усиленное образование NET в нейтрофилах пациентов с AAV, поскольку несколько ядер изменили свою типичную дольчатую структуру и высвободили волокна ДНК () по сравнению с нейтрофилами HC ().Мы обнаружили, что 19 · 57 ± 1 · 051% нейтрофилов от пациентов с AAV продуцировали NET по сравнению с 12 · 86 ± 1 · 528% нейтрофилов HC (, ** P <0,01). Затем мы попытались определить, присутствовали ли нацеленные на ANCA аутоантигены PR3, MPO и LAMP-2 в СЕТИ пациентов с AAV. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что LAMP-2, MPO и PR3 совместно локализованы во внеклеточных волокнах хроматина от пациентов с AAV (). Как недавно сообщалось, своеобразная структура NETs способствует загрузке нейтрофильных цитоплазматических антигенов в миелоидные дендритные клетки (mDC) и индуцирует продукцию ANCA и аутоиммунитет 22.Эти данные предполагают, что внутриклеточные аутоантигены, высвобождаемые при НЕТозе, могут вызывать составляющие нейтрофилов, поскольку эндогенные сигналы опасности подвергают иммунную систему опасности и нарушают иммунную толерантность.

    Высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET) в нейтрофилах периферической крови пациентов с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA), ассоциированными с васкулитом (AAV). (a, b) Флуоресцентная визуализация образования NET нейтрофилами, выделенными от пациентов с AAV (a) и здоровых контролей (HC) (b) после инкубации в течение 1 часа in vitro и окрашивания на ДНК с использованием 4 ', 6-диамидино-2 -фенилиндол (DAPI).(c) Количественное определение NET-образующих нейтрофилов от пациентов с HC или AAV с помощью флуоресцентного микроскопического анализа (** P <0,01). (d) Иммунофлуоресцентный анализ AAV-NET, идентифицированных путем совместной локализации с внеклеточной ДНК (синий), гистонами (красный) и белками нейтрофильных гранул миелопероксидазой (MPO), протеиназой 3 (PR3) или лизосомальным мембранным белком-2 (LAMP-2). ) (зеленый).

    Анти-LAMP-2 антитело способствует образованию NET в нейтрофилах

    Человеческое LAMP-2 антитело представляет новый подтип ANCA, хотя его роль в AAV остается спорной 23.В отличие от MPO и PR3, человеческий LAMP-2 обильно экспрессируется как на нейтрофильных, так и на эндотелиальных поверхностях и перемещается между лизосомами и клеточной мембраной; таким образом, LAMP-2 напрямую доступен для циркулирующих антител 24. Kessenbrock et al . 12 сообщили, что ANCA, которые специфичны для MPO и PR3, индуцируют праймированные нейтрофилы человека с образованием NET in vitro ; поэтому мы исследовали, имеют ли антитела против человеческого LAMP-2 такой же эффект на незапраймированные нейтрофилы.Некоторые нейтрофилы, выделенные из HC, стимулированного h5B4 (20 мк / мл), моноклональным IgG против человеческого LAMP-2, в течение 180 минут, проявляли типичные характеристики NET, включая «морфологически измененные ядра» и «сетчатые структуры», по сравнению с нейтрофилы, обработанные изотип-специфическим контрольным антителом, которые были визуализированы с помощью SEM () и флуоресцентной микроскопии (). h5B4 (20 мкг / мл) вызывал образование NET из 25,5 ± 1,88% этих нейтрофилов по сравнению с 11,7 ± 0/94% для изотип-специфических антител (, *** P <0,001) .Для дальнейшего изучения динамического процесса образования NET, стимулированные h5B4 нейтрофилы отслеживали с помощью визуализации живых клеток с использованием не проницаемой для клеток ДНК-красителя Sytox green вместе с проницаемой для клеток ДНК-красителя Hoechst33342. Со временем NET, характеризующиеся деконденсацией внутриклеточного хроматина с последующим распадом плазматической мембраны, были обнаружены в нейтрофилах, обработанных h5B4 ().

    Нейтрофилы, обработанные антителом против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2), высвобождают внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET).(a, b) Здоровые контрольные (HC) нейтрофилы инкубировали с h5B4 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 180 мин. (а) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) анализ образования NET на основе появления уплощенных клеток, образующих множество выступов мембраны. (b) Флуоресцентный микроскопический анализ образования NET, основанный на появлении увеличенных ядер, высвобождающих внеклеточные волокна ДНК, окрашенные 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). (c) Количественная оценка NET-образующих нейтрофилов (*** P <0,001).(d) Нейтрофилы, стимулированные h5B4, контролировались каждые 3 минуты в течение 180 минут с помощью визуализации живых клеток по трем параметрам: морфология с использованием дифференциального контрастирования интерфейса (DIC), хроматин с использованием маркера проницаемой для клеток ДНК Hoechst 33342 (синий) и внеклеточной ДНК. с использованием непроницаемого для клеток ДНК-красителя Sytox Green (зеленый). Показаны репрезентативные моменты времени.

    Антитело против LAMP-2 ингибирует спонтанный апоптоз нейтрофилов

    Для поддержания количества гомеостатических клеток старые нейтрофилы постоянно умирают в результате апоптоза 25.Сообщалось, что апоптоз нейтрофилов в AAV не регулируется, что способствует накоплению нейтрофилов в тканях AAV 26. Таким образом, мы оценили влияние антитела против LAMP-2 на скорость спонтанного апоптоза in vitro нейтрофилов. . Скорость апоптоза нейтрофилов у здоровых людей, получавших h5B4 или изотип-специфическое контрольное антитело, количественно определяли с помощью FACS через 24 часа в культуре. Результаты показали значительно более низкую скорость апоптоза в нейтрофилах, обработанных h5B4, по сравнению с контрольными изотипами (,, *** P <0,001).Этот результат согласуется с открытием, что антитела против LAMP-2 активируют нейтрофилы с образованием NET, а не подвергаются апоптозу. Интересно, что мы обнаружили, что предварительная обработка нейтрофилов 3MA или LY294002, которые использовались в качестве специфических ингибиторов аутофагии, ослабляла этот эффект h5B4 за счет повышения скорости апоптоза нейтрофилов, обработанных h5B4 (,, * P <0,05, ** P <0,01).

    Антитело против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2) ингибирует спонтанный апоптоз нейтрофилов.Апоптотические клетки детектировали с помощью проточной цитометрии с использованием аннексина V-Alexa Fluor 488 / PI. (а) Нейтрофилы инкубировали с изотип-специфическим контрольным антителом или h5B4 в течение 24 часов. (b) Нейтрофилы предварительно обрабатывали 3-метиладенином (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-оном (LY294002) (LY294002) в течение 15 минут, а затем стимулировали h5B4 в течение 24 часов. (c) Показаны проценты апоптозных нейтрофилов (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными h5B4).

    Образование NET, индуцированное антителом против LAMP-2, включает аутофагию

    Для дальнейшего изучения возможной роли аутофагического аппарата в высвобождении NET, индуцированном антителом против LAMP-2, 3MA и LY294002 были использованы в качестве ингибиторов PI3K. Предварительная обработка (15 мин) нейтрофилов HC этими агентами перед добавлением h5B4 значительно снизила процент клеток, выделяющих NET (,). Однако эти индуцированные h5B4 NET были нечувствительны к zVAD-fmk, который предотвращает апоптоз, и Nec-1, ингибитору некроза через путь киназы RPI1 ().В совокупности эти данные предполагают, что аутофагический аппарат участвует в индуцированном антителом LAMP-2 образовании NET.

    Передача сигналов фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) необходима для индуцированного антителами образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET), индуцированного антителом против лизосомного мембранного белка-2 (LAMP-2). (а) Предварительная обработка 3-метиладенином (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-оном (LY294002) в течение 15 минут предотвращает высвобождение NET из нейтрофилов, обработанных h5B4, в течение 180 минут. NET обнаруживали совместным окрашиванием ДНК (синий) и миелопероксидазой (МПО) (зеленый) и визуализировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.(b) Влияние предварительной обработки 3MA, LY294002, бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетон (zVAD-fmk) или некростатином-1 (Nec-1) на процентное содержание нейтрофилов, высвобождающих NET, стимулированных -h5B4 ( * P <0,05; ns = несущественно по сравнению с клетками, обработанными h5B4).

    Более того, активация аутофагии в нейтрофилах, обработанных h5B4, отслеживалась на основании локализации иммунофлуоресценции LC3B. Во время раннего периода индукции аутофагии LC3B перемещается из цитоплазмы во вновь сформированные аутофагосомы 27.В течение 30 минут после стимуляции h5B4 мы наблюдали точечные структуры LC3B, которые типичны для аутофагии, и этот эффект был уменьшен 3MA (). Способность h5B4 стимулировать аутофагию была дополнительно продемонстрирована с помощью иммуноблоттинга для LC3B (** P <0,01). Сообщалось, что многие типы клеток демонстрируют массивную вакуолизацию во время связанной с аутофагией гибели клеток 28. ТЕМ-анализ нейтрофилов выявил наличие массивной вакуолизации, типичной для аутофагии, когда нейтрофилы обрабатывались h5B4 в течение 30 минут ().Эти вакуоли не наблюдались в нейтрофилах, обработанных изотип-специфическими антителами, которые характеризуются многодольчатыми ядрами и различными типами гранул ().

    Антитело против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2) способствует аутофагии нейтрофилов. (а) Иммунофлуоресцентное окрашивание на LC3B в нейтрофилах, обработанных h5B4 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 30 мин. Аутофагию оценивали на основании образования LC3B-позитивных аутофагосом. ДНК метили с использованием 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий), и LC3B детектировали с использованием поликлонального антитела против LC3B (красный).(b) Анализ и количественная оценка превращения LC3BI в LC3BII в нейтрофилах, обработанных изотипическим контрольным антителом (дорожка I) или h5B4 (дорожка II) в течение 30 минут, и эффекта 3-метиладенина (3MA) (дорожка III) и 2- морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-он (LY294002) (полоса IV) на клетках, обработанных h5B4, по оценке иммуноблоттинга на LC3B (** P <0,01 по сравнению с клетками, обработанными h5B4). (c, d) Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) показывает массивную вакуолизацию нейтрофилов, обработанных h5B4 в течение 30 минут (c), но не клеток, обработанных контрольным изотипом антител (d).

    Обсуждение

    НЕТоз играет важную роль в воздействии аутоантигенов на иммунную систему и вызывает деструктивный некротический васкулит при различных состояниях, таких как системная красная волчанка (СКВ) 29 и AAV 12. LAMP-2 является новой мишенью для ANCA наряду с более известные цели PR3 и MPO. LAMP-2 является основным компонентом лизосомальной мембраны, которая обнаруживается не только выстилающей гранулы нейтрофилов, но также и на поверхности клетки, и играет роль в аутофагии 23.

    Это исследование является первым, демонстрирующим, что образование NET, индуцированное LAMP-2 ANCA, включает запуск аутофагического аппарата. Наши экспериментальные данные показывают, что антитело против LAMP-2 ингибирует спонтанный апоптоз и активирует аутофагию нейтрофилов, активируя высвобождение NET in vitro в нейтрофилах, и что ингибирование передачи сигналов PI3K снижает аутофагию и препятствует высвобождению NET. Мы также предоставляем доказательства того, что усиленные NET откладывались в биопсиях почек и высвобождались периферическими нейтрофилами у пациентов с AAV, и что LAMP-2 совместно локализовался в NET у пациентов с AAV.

    Нейтрофилы могут высвобождать АФК и протеазы в тканевое микроокружение, приводя к воспалению и повреждению тканей, которые, как считается, служат критическими эффекторными клетками, ответственными за сосудисто-некротическое воспаление при AAV. При культивировании in vitro эти клетки подвергаются спонтанному апоптозу в отсутствие достаточных концентраций факторов выживания нейтрофилов 30. Нейтрофилы удаляются из тканей посредством некроза или апоптоза с последующим фагоцитозом марофагии 31.Дефекты в путях апоптоза могут приводить к сохранению аутореактивных Т- или В-клеток и развитию аутоиммунных заболеваний, включая AAV 32. В последние 20 лет апоптоз и вторичный некроз считались основными источниками аутоантигенов в патогенезе системных аутоиммунных заболеваний. Поскольку НЕТоз представляет собой эффективную иллюстрацию механизма, с помощью которого внутриклеточные аутоантигены подвергаются иммунным ответам, НЕТоз недавно вызвал повышенный интерес к AAV 33,34.Сети, состоящие в основном из внутриклеточных и внутриядерных материалов, могут быть потенциальными аутоантигенами для иммунной системы 35 и напрямую повреждать эндотелиальные клетки сосудов 36. Повышенное образование NET наблюдалось при СКВ 37, ревматоидном артрите (РА) 35, дерматомиозите (СД) 38 и AAV 12 , среди прочего. Наше исследование показывает, что усиленные NET откладывались в биоптатах почек пациентов с AAV и высвобождались периферическими нейтрофилами, что является феноменом, который обычно подвергает внутриклеточные аутоантигены иммунной системе, предполагая их патогенную роль в индукции воспаления при AAV.Более того, эти волокнистые отложения ДНК, которые содержат целевые аутоантигены LAMP-2, MPO и PR3, которые делают структуры NET высокоиммуногенными, предназначены для активации плазматических дендритных клеток (pDC) и аутореактивных B-клеток в Toll-подобном рецепторе 9-зависимом образом, как сообщалось ранее 39,40.

    Апоптоз и некроз - две основные формы смерти нейтрофилов. Кроме того, аутофагия недавно была причастна к гибели нейтрофильных клеток 41. Аутофагия - это хорошо законсервированный, существенный внутриклеточный процесс деградации, который, как известно, регулирует обмен белков и органелл, и который составляет решающий механизм врожденного иммунитета во многих типах клеток 42, 43.Аутофагия также участвует в адаптивных иммунных ответах, играя ключевую роль в процессинге антигена для презентации главного комплекса гистосовместимости (MHC) и в развитии, выживании и пролиферации лимфоцитов, которые, по-видимому, регулируются ненормально при аутоиммунных заболеваниях 44. В этом исследовании zVAD-fmk и Nec-1 использовались в качестве ингибиторов апоптоза и некроза соответственно, тогда как 3MA и LY294002 использовались в качестве ингибиторов PI3K. Мы обнаружили, что ни ингибирование каспаз с помощью zVAD-fmk, ни ингибирование киназ RIP1 с помощью Nec-1 не влияет на образование NET, индуцированное антителом против LAMP-2.Эти результаты согласуются с НЕТозом, различающимся между апоптозом и некрозом не только морфологически, но и биохимически. Однако как 3MA, так и LY294002 значительно ингибировали индуцированное антителом LAMP-2 образование NET. Таким образом, мы предполагаем, что для высвобождения этих внеклеточных структур необходим механизм аутофагии. Это предположение согласуется с недавним сообщением, демонстрирующим, что ингибирование аутофагии в нейтрофилах, обработанных PMA, предотвращает NETosis и ведет к апоптической гибели клеток 45.Однако ингибирование передачи сигналов PI3K не подавляло полностью индуцированное антителом LAMP-2 образование NET до контрольных уровней. В основе НЕТоза должны лежать другие регуляторные механизмы. Существует по крайней мере три различных типа аутофагии, включая макроаутофагию, шаперон-опосредованную аутофагию (CMA) и микроаутофагию. Макроаутофагия, обычно называемая просто аутофагией, является предметом нашего исследования. CMA и микроаутофагия не представляли сложности в этом исследовании и должны быть изучены в дальнейших исследованиях. Генетические данные о механизмах повышенного образования NET у пациентов с AAV отсутствуют.Поэтому здесь потребуются большие усилия.

    В заключение, наши данные указывают на то, что NET образуются во время аутоиммунных атак AAV, и предполагают связь между высвобождением NET, индуцированным анти-LAMP-2-антителами, и передачей сигналов, связанной с аутофагией. Необходимы дальнейшие исследования для оценки аутофагического механизма in vivo в NET-образующих нейтрофилах пациентов с AAV и для изучения точных сигнальных путей, ведущих к ANCA-стимулированному НЕТозу.

    Благодарности

    Авторы благодарят всех пациентов и здоровых добровольцев, принявших участие в этом исследовании.Мы благодарим нашего сотрудника г-жу Цзинь Пэн за помощь в конфокальной микроскопии и анализе изображений живых клеток. Мы также благодарим г-жу Сяолань Фу за ее помощь в анализе FACS. Это исследование было поддержано Национальным научным фондом Китая (30971366), Проектами международного сотрудничества Чунцинского комитета по науке и технологиям (CSTC201110004) и Проектом клинических исследований Третьего военно-медицинского университета (2011XLC37).

    Вклад авторов

    J.Б.З. принимал участие во всех аспектах концепции, дизайна и направления исследования и обеспечивал окончательное одобрение представленной рукописи. Разработкой исследования занимались J. B. Z., A. S. G. и Y. Z. W. J. B. Z., S. T., L. Y. S., L. W. и S. W. Y. принимали участие в сборе данных, анализе данных и интерпретации результатов. S. T., Y. Z., X. J. G., W. W. S. и L. Y. Z. провели лабораторные испытания. Y. W., X. H., J. H. Z. и Y. J. H. участвовали в клиническом анализе. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

    Ссылки

    Jennette JC, Falk RJ, Hu P, et al. Патогенез васкулита мелких сосудов, ассоциированного с антинейтрофильными цитоплазматическими аутоантителами. Анну Рев Патол. 2013; 8: 139–60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Калленберг CG. Патогенез ANCA-ассоциированных васкулитов. Ann Rheum Dis. 2011; 70 (Приложение 1): i59–63. [PubMed] [Google Scholar] Каин Р., Мацуи К., Экснер М. и др. Новый класс аутоантигенов цитоплазматических антител против нейтрофилов при некротическом и серповидном гломерулонефрите: гликопротеин лизосомальной мембраны h-lamp-2 в нейтрофильных гранулоцитах и ​​родственный мембранный белок в эндотелиальных клетках клубочков.J Exp Med. 1995; 181: 585–97. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Jennette JC, Falk RJ. Патогенез заболевания, опосредованного антинейтрофильными цитоплазматическими аутоантителами. Nat Rev Rheumatol. 2014; 10: 463–73. [PubMed] [Google Scholar] Каин Р., Тадема Х., Маккинни Э.Ф. и др. Высокая распространенность аутоантител к hLAMP-2 при васкулите, ассоциированном с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами. J Am Soc Nephrol. 2012; 23: 556–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Рот AJ, Brown MC, Smith RN, et al. Антитела против LAMP-2 не распространены у пациентов с гломерулонефритом антинейтрофильных цитоплазматических аутоантител.J Am Soc Nephrol. 2012; 23: 545–55. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Zhang Y, Shi W, Tang S, et al. Влияние кателицидина LL37 на васкулит, ассоциированный с человеческими антителами к цитоплазматическим антителам (ANCA). Arthritis Res Ther. 2013; 15: R161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Боррегаард Н. Нейтрофилы, от костного мозга до микробов. Иммунитет. 2010; 33: 657–70. [PubMed] [Google Scholar] Бринкманн В., Райхард У., Гусманн С. и др. Внеклеточные ловушки нейтрофилов убивают бактерии. Наука.2004; 303: 1532–5. [PubMed] [Google Scholar] Кессенброк К., Крумбхольц М., Шонермарк У. и др. Сетчатые нейтрофилы при аутоиммунном васкулите мелких сосудов. Nat Med. 2009; 15: 623–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Ученый Google] Накадзава Д., Шида Х., Томару У. и др. Повышенное образование и нарушение регуляции NET при микроскопическом полиангиите, ассоциированном с миелопероксидазой-ANCA. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 990–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Ученый Google] Накадзава Д., Томару Ю., Ямамото С. и др. Обильные внеклеточные ловушки нейтрофилов в тромбе пациента с микроскопическим полиангиитом.Фронт Иммунол. 2012; 3: 333. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Ученый Google] Накадзава Д., Томару У, Судзуки А. и др. Аномальная конформация и нарушенная деградация пропилтиоурацил-индуцированных внеклеточных ловушек нейтрофилов: последствия неупорядоченных внеклеточных ловушек нейтрофилов в крысиной модели васкулита, ассоциированного с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами миелопероксидазы. Ревматоидный артрит. 2012; 64: 3779–87. [PubMed] [Google Scholar] Купер П.Р., Палмер Л.Дж., Чаппл, Иллинойс. Внеклеточные ловушки нейтрофилов как новая парадигма врожденного иммунитета: друг или враг? Периодонтол 2000.2013; 63: 165–97. [PubMed] [Google Scholar] Эскелинен Э.Л. Роль LAMP-1 и LAMP-2 в биогенезе лизосом и аутофагии. Мол Аспекты Мед. 2006; 27: 495–502. [PubMed] [Google Scholar] Митроулис И., Куртзелис И., Камбас К. и др. Регулирование аутофагического аппарата нейтрофилов человека. Eur J Immunol. 2010; 40: 1461–72. [PubMed] [Google Scholar] Дженнетт Дж. К., Фальк Р. Дж., Андрасси К. и др. Номенклатура системных васкулитов. Предложение о международной конференции консенсуса. Ревматоидный артрит. 1994; 37: 187–92.[PubMed] [Google Scholar] Сангалетти С., Триподо С., Чиодони С. и др. Внеклеточные ловушки нейтрофилов опосредуют перенос цитоплазматических нейтрофильных антигенов к миелоидным дендритным клеткам в направлении индукции ANCA и связанного с ним аутоиммунитета. Кровь. 2012; 120: 3007–18. [PubMed] [Google Scholar] Флинт С.М., Savage CO. Аутоантитела против LAMP-2 при ANCA-ассоциированном паучиммунном гломерулонефрите. J Am Soc Nephrol. 2012; 23: 378–80. [PubMed] [Google Scholar] Гоф Н.Р., Фамбро Д.М. Различные устойчивые субклеточные распределения трех вариантов сплайсинга ассоциированного с лизосомами мембранного белка LAMP-2 в значительной степени определяются COOH-концевым аминокислотным остатком.J Cell Biol. 1997; 137: 1161–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Ученый Google] Абдгавад М., Петтерссон А., Гуннарссон Л. и др. Снижение апоптоза нейтрофилов при неактивном ANCA-ассоциированном системном васкулите. PLOS ONE. 2012; 7: e32439. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Клионский Д. Д., Абелиович Х., Агостинис П. и др. Рекомендации по использованию и интерпретации анализов для мониторинга аутофагии у высших эукариот. Аутофагия. 2008; 4: 151–75. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Кремер Г., Галлуцци Л., Ванденабил П. и др.Классификация клеточной смерти: рекомендации Номенклатурного комитета по клеточной смерти 2009. Cell Death Differ. 2009; 16: 3–11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Ученый Google] Вильянуэва Э., Ялаварти С., Бертье С.К. и др. Сетчатые нейтрофилы вызывают повреждение эндотелия, инфильтрируют ткани и обнажают иммуностимулирующие молекулы при системной красной волчанке. J Immunol. 2011; 187: 538–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Луо Х.Р., Луазон Ф. Конститутивный апоптоз нейтрофилов: механизмы и регуляция.Am J Hematol. 2008; 83: 288–95. [PubMed] [Google Scholar] Кобаяши С.Д., Войич Дж. М., Бурлак С. и др. Нейтрофилы во врожденном иммунном ответе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2005; 53: 505–17. [PubMed] [Google Scholar] Knight JS, Carmona-Rivera C, Kaplan MJ. Белки, полученные из внеклеточных ловушек нейтрофилов, могут служить аутоантигенами и опосредовать повреждение органов при аутоиммунных заболеваниях. Фронт Иммунол. 2012; 3: 380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Рамирес Г.А., Маугери Н., Саббадини М.Г. и др. Внутрисосудистый иммунитет как ключ к системному васкулиту: работа продолжается, набирает обороты.Clin Exp Immunol. 2014; 175: 150–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Khandpur R, Carmona-Rivera C, Vivekanandan-Giri A, et al. NET являются источником цитруллинированных аутоантигенов и стимулируют воспалительные реакции при ревматоидном артрите. Sci Transl Med. 2013; 5: 178ra40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Саффарзаде М., Юенеманн С., Кайссер М.А. и др. Внеклеточные ловушки нейтрофилов непосредственно вызывают гибель эпителиальных и эндотелиальных клеток: преобладающая роль гистонов. PLOS ONE.2012; 7: e32366. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Zhang S, Shu X, Tian X и др. Повышенное образование и нарушение деградации внеклеточных ловушек нейтрофилов при дерматомиозите и полимиозите: потенциальный фактор интерстициальных осложнений заболеваний легких. Clin Exp Immunol. 2014; 177: 134–41. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Ланде Р., Грегорио Дж., Факкинетти В. и др. Плазмацитоидные дендритные клетки воспринимают собственную ДНК, связанную с антимикробным пептидом. Природа. 2007; 449: 564–9.[PubMed] [Google Scholar] Leadbetter EA, Rifkin IR, Hohlbaum AM, et al. Комплексы хроматин-IgG активируют В-клетки за счет двойного взаимодействия IgM и Toll-подобных рецепторов. Природа. 2002; 416: 603–7. [PubMed] [Google Scholar] фон Гунтен С., Юсефи С., Зейтц М. и др. Сиглек-9 преобразует сигналы апоптотической и неапоптотической смерти в нейтрофилы в зависимости от среды провоспалительных цитокинов. Кровь. 2005; 106: 1423–31. [PubMed] [Google Scholar] Пьердоминичи М., Вомеро М., Барбати С. и др. Роль аутофагии в иммунитете и аутоиммунитете, с особым вниманием к системной красной волчанке.FASEB J. 2012; 26: 1400–12. [PubMed] [Google Scholar] Ремийсен К., Ванден Берге Т., Вираван Э. и др. Гибель нейтрофильных внеклеточных клеток-ловушек требует как аутофагии, так и образования супероксида. Cell Res. 2011; 21: 290–304. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

    журналов открытого доступа | OMICS International

    • Дом
    • О нас
    • Открытый доступ
    • Журналы
      • Поиск по теме
          • Журнал открытого доступа
          • Acta Rheumatologica Журнал открытого доступа
          • Достижения в профилактике рака Журнал открытого доступа
          • Американский журнал этномедицины
          • Американский журнал фитомедицины и клинической терапии
          • Обезболивание и реанимация: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
          • Анатомия и физиология: текущие исследования Журнал открытого доступа
          • Андрология и гинекология: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
          • Андрология - открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Анестезиологические коммуникации
          • Ангиология: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Летопись инфекций и антибиотиков Журнал открытого доступа
          • Архивы исследований рака Журнал открытого доступа
          • Архив расстройств пищеварения
          • Архивы медицины Журнал открытого доступа
          • Archivos de Medicina Журнал открытого доступа
          • Рак груди: текущие исследования Журнал открытого доступа
          • Британский биомедицинский бюллетень Журнал открытого доступа
          • Отчет о слушаниях в Канаде Журнал открытого доступа
          • Химиотерапия: открытый доступ Официальный журнал Итало-латиноамериканского общества этномедицины
          • Хроническая обструктивная болезнь легких: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Отчеты о клинических и медицинских случаях
          • Журнал клинической гастроэнтерологии Журнал открытого доступа
          • Клиническая детская дерматология Журнал открытого доступа
          • Колоректальный рак: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Косметология и хирургия лица Журнал открытого доступа
          • Акушерство и гинекология интенсивной терапии Журнал открытого доступа
          • Текущие исследования: интегративная медицина Журнал открытого доступа
          • Стоматологическое здоровье: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
          • Стоматология Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии
          • Дерматология и дерматологические заболевания Журнал открытого доступа
          • Отчеты о случаях дерматологии Журнал открытого доступа
          • Диагностическая патология: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Неотложная медицина: открытый доступ Официальный журнал Всемирной федерации обществ педиатрической интенсивной терапии и реанимации
          • Эндокринология и диабетические исследования Гибридный журнал открытого доступа
          • Эндокринология и метаболический синдром Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ
          • Эндокринологические исследования и метаболизм
          • Эпидемиология: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Европейский журнал спорта и науки о физических упражнениях
          • Доказательная медицина и практика Журнал открытого доступа
          • Семейная медицина и медицинские исследования Журнал открытого доступа
          • Лечебное дело: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Гинекология и акушерство Журнал открытого доступа, Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ
          • Отчет о гинекологии и акушерстве Журнал открытого доступа
          • Лечение волос и трансплантация Журнал открытого доступа
          • Исследования рака головы и шеи Журнал открытого доступа
          • Гепатология и панкреатология
          • Фитотерапия: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Анализ артериального давления Журнал открытого доступа
          • Информация о заболеваниях грудной клетки Журнал открытого доступа
          • Информация о гинекологической онкологии Журнал открытого доступа
          • Внутренняя медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Международный журнал болезней органов пищеварения Журнал открытого доступа
          • Международный журнал микроскопии
          • Международный журнал физической медицины и реабилитации Журнал открытого доступа
          • JOP.Журнал поджелудочной железы Журнал открытого доступа
          • Журнал аденокарциномы Журнал открытого доступа
          • Журнал эстетической и реконструктивной хирургии Журнал открытого доступа
          • Журнал старения и гериатрической психиатрии
          • Журнал артрита Журнал открытого доступа
          • Журнал спортивного совершенствования Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал автакоидов и гормонов
          • Журнал крови и лимфы Журнал открытого доступа
          • Журнал болезней крови и переливания Журнал открытого доступа, Официальный журнал Международной федерации талассемии
          • Журнал исследований крови и гематологических заболеваний Журнал открытого доступа
          • Журнал отчетов и рекомендаций по костям Журнал открытого доступа
          • Журнал костных исследований Журнал открытого доступа
          • Журнал исследований мозга
          • Журнал клинических испытаний рака Журнал открытого доступа
          • Журнал диагностики рака Журнал открытого доступа
          • Журнал исследований рака и иммуноонкологии Журнал открытого доступа
          • Журнал онкологической науки и исследований Журнал открытого доступа
          • Журнал канцерогенеза и мутагенеза Журнал открытого доступа
          • Журнал кардиологической и легочной реабилитации
          • Журнал клеточной науки и апоптоза
          • Журнал детства и нарушений развития Журнал открытого доступа
          • Журнал детского ожирения Журнал открытого доступа
          • Журнал клинических и медицинских исследований
          • Журнал клинической и молекулярной эндокринологии Журнал открытого доступа
          • Журнал клинической анестезиологии: открытый доступ
          • Журнал клинической иммунологии и аллергии Журнал открытого доступа
          • Журнал клинической микробиологии и противомикробных препаратов
          • Журнал клинических респираторных заболеваний и ухода Журнал открытого доступа
          • Журнал коммуникативных расстройств, глухих исследований и слуховых аппаратов Журнал открытого доступа
          • Журнал врожденных заболеваний
          • Журнал контрацептивных исследований Журнал открытого доступа
          • Журнал стоматологической патологии и медицины
          • Журнал диабета и метаболизма Официальный журнал Европейской ассоциации тематической сети по биотехнологиям
          • Журнал диабетических осложнений и медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал экологии и токсикологии Журнал открытого доступа
          • Журнал судебной медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал желудочно-кишечной и пищеварительной системы Журнал открытого доступа
          • Журнал рака желудочно-кишечного тракта и стромальных опухолей Журнал открытого доступа
          • Журнал генитальной системы и заболеваний Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал геронтологии и гериатрических исследований Журнал открытого доступа
          • Журнал токсичности и болезней тяжелых металлов Журнал открытого доступа
          • Журнал гематологии и тромбоэмболических заболеваний Журнал открытого доступа
          • Журнал гепатита Журнал открытого доступа
          • Журнал гепатологии и желудочно-кишечных расстройств Журнал открытого доступа
          • Журнал HPV и рака шейки матки Журнал открытого доступа
          • Журнал гипертонии: открытый доступ Журнал открытого доступа, Официальный журнал Словацкой лиги против гипертонии
          • Журнал визуализации и интервенционной радиологии Журнал открытого доступа
          • Журнал интегративной онкологии Журнал открытого доступа
          • Журнал почек Журнал открытого доступа
          • Журнал лейкемии Журнал открытого доступа
          • Журнал печени Журнал открытого доступа
          • Журнал печени: болезни и трансплантация Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал медицинской и хирургической патологии Журнал открытого доступа
          • Журнал медицинских диагностических методов Журнал открытого доступа
          • Журнал медицинских имплантатов и хирургии Журнал открытого доступа
          • Журнал медицинской онкологии и терапии
          • Журнал медицинской физики и прикладных наук Журнал открытого доступа
          • Журнал медицинской физиологии и терапии
          • Журнал медицинских исследований и санитарного просвещения
          • Журнал медицинской токсикологии и клинической судебной медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал метаболического синдрома Журнал открытого доступа
          • Журнал микробиологии и патологии
          • Журнал молекулярной гистологии и медицинской физиологии Журнал открытого доступа
          • Журнал молекулярной патологии и биохимии
          • Журнал морфологии и анатомии
          • Журнал молекулярно-патологической эпидемиологии MPE Журнал открытого доступа
          • Журнал неонатальной биологии Журнал открытого доступа
          • Журнал новообразований Журнал открытого доступа
          • Журнал нефрологии и почечных заболеваний Журнал открытого доступа
          • Журнал нефрологии и терапии Журнал открытого доступа
          • Журнал исследований нейроэндокринологии
          • Журнал новых физиотерапевтических методов Журнал открытого доступа
          • Журнал расстройств питания и терапии Журнал открытого доступа
          • Журнал ожирения и расстройств пищевого поведения Журнал открытого доступа
          • Журнал ожирения и терапии Журнал открытого доступа
          • Журнал терапии ожирения и похудания Журнал открытого доступа
          • Журнал ожирения и метаболизма
          • Журнал одонтологии
          • Журнал онкологической медицины и практики Журнал открытого доступа
          • Журнал онкологических исследований и лечения Журнал открытого доступа
          • Журнал трансляционных исследований онкологии Журнал открытого доступа
          • Журнал гигиены полости рта и здоровья Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии
          • Журнал ортодонтии и эндодонтии Журнал открытого доступа
          • Журнал ортопедической онкологии Журнал открытого доступа
          • Журнал остеоартрита Журнал открытого доступа
          • Журнал остеопороза и физической активности Журнал открытого доступа
          • Журнал отологии и ринологии Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал детской медицины и хирургии
          • Журнал по лечению боли и медицине Журнал открытого доступа
          • Журнал паллиативной помощи и медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал периоперационной медицины
          • Журнал физиотерапии и физической реабилитации Журнал открытого доступа
          • Журнал исследований и лечения гипофиза
          • Журнал беременности и здоровья ребенка Журнал открытого доступа
          • Журнал профилактической медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал рака простаты Журнал открытого доступа
          • Журнал легочной медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал пульмонологии и респираторных заболеваний
          • Журнал редких заболеваний: диагностика и терапия
          • Журнал регенеративной медицины Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал репродуктивной биомедицины
          • Журнал сексуальной и репродуктивной медицины подписка
          • Журнал спортивной медицины и допинговых исследований Журнал открытого доступа
          • Журнал стероидов и гормонологии Журнал открытого доступа
          • Журнал хирургии и неотложной медицины Журнал открытого доступа
          • Журнал хирургии Jurnalul de Chirurgie Журнал открытого доступа
          • Журнал тромбоза и кровообращения: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Журнал заболеваний щитовидной железы и терапии Журнал открытого доступа
          • Журнал традиционной медицины и клинической натуропатии Журнал открытого доступа
          • Журнал травм и лечения Журнал открытого доступа
          • Журнал травм и интенсивной терапии
          • Журнал исследований опухолей Журнал открытого доступа
          • Журнал исследований и отчетов по опухолям Журнал открытого доступа
          • Журнал сосудистой и эндоваскулярной терапии Журнал открытого доступа
          • Журнал сосудистой медицины и хирургии Журнал открытого доступа
          • Журнал женского здоровья, проблем и ухода Гибридный журнал открытого доступа
          • Журнал йоги и физиотерапии Журнал открытого доступа, Официальный журнал Федерации йоги России и Гонконгской ассоциации йоги
          • La Prensa Medica
          • Контроль и ликвидация малярии Журнал открытого доступа
          • Материнское и детское питание Журнал открытого доступа
          • Медицинские и клинические обзоры Журнал открытого доступа
          • Медицинская и хирургическая урология Журнал открытого доступа
          • Отчеты о медицинских случаях Журнал открытого доступа
          • Медицинские отчеты и примеры из практики в открытом доступе
          • Нейроонкология: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Медицина труда и здоровье Журнал открытого доступа
          • Радиологический журнал OMICS Журнал открытого доступа
          • Отчеты о онкологии и раковых заболеваниях Журнал открытого доступа
          • Здоровье полости рта и лечение зубов Журнал открытого доступа Официальный журнал Лондонской школы лицевой ортотропии
          • Отчеты о заболеваниях полости рта Журнал открытого доступа
          • Ортопедическая и мышечная система: текущие исследования Журнал открытого доступа
          • Отоларингология: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Заболевания поджелудочной железы и терапия Журнал открытого доступа
          • Педиатрическая помощь Журнал открытого доступа
          • Скорая педиатрическая помощь и медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа
          • Педиатрия и медицинские исследования
          • Педиатрия и терапия Журнал открытого доступа
          • Пародонтология и протезирование Журнал открытого доступа
          • Психология и психиатрия: открытый доступ
          • Реконструктивная хирургия и анапластология Журнал открытого доступа
          • Отчеты о раке и лечении
          • Отчеты в маркерах заболеваний
          • Отчеты в исследованиях щитовидной железы
          • Репродуктивная система и сексуальные расстройства: текущие исследования Журнал открытого доступа
          • Исследования и обзоры: Journal of Dental Sciences Журнал открытого доступа
          • Исследования и обзоры: медицинская и клиническая онкология
          • Исследования и отчеты в гастроэнтерологии Журнал открытого доступа
          • Исследования и отчеты в области гинекологии и акушерства
          • Кожные заболевания и уход за кожей Журнал открытого доступа
          • Хирургия: Текущие исследования Официальный журнал Европейского общества эстетической хирургии
          • Трансляционная медицина Журнал открытого доступа
          • Травмы и неотложная помощь Журнал открытого доступа
          • Тропическая медицина и хирургия Журнал открытого доступа
          • Универсальная хирургия Журнал открытого доступа
          • Всемирный журнал фармакологии и токсикологии

    Откройте для себя выставки современного искусства | Ocula

    В состав художественной галереи Ocula входят такие галереи, как Галерея Тины Ким в Нью-Йорке, Галерея Така Исии в Токио, галереи Дэвида Цвирнера и Виктории Миро в Лондоне, Саймона Ли в Лондоне и Гонконге и Альмин Рех в Париже и Брюсселе.Ocula предоставляет полезную информацию об истории и прошлом каждой галереи, текущих и предстоящих художественных выставках, художниках и произведениях искусства.

    Благодаря стремлению к представлению выставок как в уже существующих, так и в новых галереях, выставки, представленные на Ocula, обширны как географически, так и тематически и включают фотовыставки, выставки живописи и выставки концептуального искусства. Галереи-члены Ocula расположены более чем в 50 городах по всему миру и включают в себя многие из самых известных художественных галерей в Азии, Европе, на Ближнем Востоке и в Америке.

    Выставки - это то самое средство, с помощью которого искусство делится с миром, представляя искусство в гибридном общественно-частном пространстве и позволяя распространять идеи через тех, кто его посещает. Выставка позволяет сопоставить искусство и контекстуализировать его, тем самым продвигая новые мысли, которые, возможно, не возникли в его первоначальном творчестве, но теперь формируются через идеи и умы людей, которые его переживают.

    Сама практика экспонирования произведений искусства имеет долгую и увлекательную историю, которая во многих отношениях имеет отношение к тому, как развивалось современное искусство.Исторически выставки ставили под сомнение саму природу искусства, вызывая споры о том, что такое искусство. Возможно, одна из самых ранних и известных выставок, ставящих под сомнение и опротестовывающую процесс отбора в выставочном формате, была выставка Salon des Refusés 1863 года, на которой были представлены работы, отклоненные для официального салона во Дворце промышленности.

    Художники-импрессионисты также смогли оставить свой след, организовав художественные выставки за пределами основных художественных институтов, тем самым вызвав переосмысление того, каким может быть искусство.Следуя истории выставки, коллекционер или куратор (или другой энтузиаст искусства) может начать формировать более глубокое понимание практики художника и программы галереи.

    Многие галереи теперь считают свои помещения абсолютно необходимыми для того, чтобы их художники могли выставлять свое искусство и делиться своими идеями, и с этой целью сегодня в галереях проводится множество выставок музейного качества. Некоторые галереи также начинают инвестировать в художественные онлайн-выставки, и в соответствующих случаях Ocula работает с этими галереями, чтобы привлечь внимание к таким выставкам.

    Нет лучшего способа познакомиться с произведениями искусства, чем в пространстве, которое художник выбирает для демонстрации работы, но там, где это невозможно, Ocula предоставляет возможную альтернативу.

    Матаса в Янкин Дельта Нигера из Камфанонин хакар человек фетур | Сияса | DW

    Ya zuwa yanzu dai tuni gwamnatin jihar Bayelsa dake kudu maso gabashin kasar ta Nigeria ta dukufa kain da nain wajen ganin an sako wadannan mutane guda shida, biyu daga cikin su Jamusawa kagowar yud.

    Идан дай за а ия тунава а джия не матасан ваданда сука даурева карья гинди та ханьяр таше ташен ханкула да кума рикиче рикиче а янкин на дельте Нигера сукайи гаркува дасу а заин да суке тайу джиргин джиргин дасу а заин да суке тайку джиргин джиргин сува а jihar Delta duka dai a yankin na Niger Delta.

    A cewar kakakin kamfamnin na B da kuma B, tuni gwamnatin ta Bayelsa ta fara tattaunawar sulhu da matasan a kokarin da take na ganin an sako mutanen guda shida ba tarte da wani daga cikin su ya jaji raunia ka.

    Ya zuwa yanzu ma dai a cewar kakakin tattaunawa game da sako mutanen tayi nisa a wani lokaci a nan gaba kadan wadan nan mutane zasu samu yancin su kamar yadda suke dashi a can baya.

    Игра кува да халин да мутанен ке цики, какакин камфанин яси габа да сева дукканнин мутане шидан на цикин квансияр ханкали да лумана, домин кува матасан сун басу дамар ганава дасу та ханьяр вайар тархо.

    а вадже дайа кума а севар вата санарва данные фито дага бангарен матасан, та шайдар да сева матасан сун дауки ваннан матакин не дон турсаса бангарен камфанин на шелл чика алкаварин да яи мусу на самар да айкин йи да гаудана дай был да айкин чи габа янкунан дав камфанин ке гуданар да аиюкан са.

    А дайа ханнун кума камфанин на шелл я таббатар да cvewa а шекарта та 2002 данные габата, камфанин я цимма ярджежения да васу кунгийойин аль, уммар янкунан да яке хакар май гуда тара акан заи гудан айкан айан айан

    Bisa hakan a cewar kakakin kamfanin na shell, kamfanin nasu ya samu damar aiwatar da wasu aiyukan, to amma ragowar za a kammala su ne a cikin wannan shekara da muke ciki izuwa cakin karkin 9000 yakin 9000 yakin 9000 як. wadannan mutane shidan kamfanin ya shirya gudanar da wani taro a tsakanin sa da alummar yankin na Iduwini don yi musu cikakken bayanin dalilin dalilin da za za a dauki lokaci mai tsawo kafin gudanayi alkudina.

    Rahotanni dai sun shaidar da cewa rikice rikice da tashe tashen hankula abubuwa ne da suka dade da zamowa ruwan dare a yankin na niger delta, a kokarin da mutanen yankin keyi na samun ingantar rayuwar su, musanfanmamon mai ts анну дайа кума да гвамнатин тарайя.

    Бугу да кари баянаи сун шайдар да сева сау да ява ирэн вадан нан матаса каньи гаркува да джамиан камфанин май янкин то амма дага байа сай а сасанта а сако су ба таре да сун тагайяра баакар кума сун ва ша.

    Даи ваннан янки на дельте Нигера не тарайяр та Нигерия ке хако даньян человек фетур дин да яван са я тасамма гагга милиян бийу да диго уку ку кулум Ранар Аллах та, ала.

    Аль-Коран дан Terjemahannya | Atiqah Najihah

    Alhamdulillah моя новая коллекция dah selamat sampai! Dah sampai dua hari lepas dan возбуждено отслеживание чеков gila tunggu bila, посылка отправлена ​​на доставку. Аль-Коран beserta terjemahannya ni dalam bahasa Melayu, bukan dalam bahasa Indonesia.

    Walaupun kita serumpun dengan Индонезия тапи ада джуга sesetengah perkataan Индонезия ян аку так фахам максудня.Тапи нормальный кан? Так семуа оранг акан фахам бахаса негара лайн, бегиту джуга себаликня.

    Дах лама себетульня нак бели аль-Коран ян ада терджемахан ни тапи макам биасалах секетул атиках наджихах, так бели бели джуга. Бели benda lain ingat pula contohnya makanan kikiki. Букан так ада аль-Коран себелум ни, тапи аль-Коран лама так ада terjemahan. Меманг аят аят сучи аль-Коран семата мата. Джади teringinlah нак бели ян ада terjemahan. Boleh baca.

    Macam mana boleh beli? Alkisahnya tengah syok scroll twitter, ternampak ada orang promot buku terjemahan al-Quran ni.Terus rasa nak beli sebab nampak menarik. Terus search di shopee sebab nak free shipping hehehe. Sebab tu, kalau nak beli apa apa, memang aku akan tuju shopee dulu. Bagus sebab ada бесплатная доставка, дан lagi bagus kalau ada cashback sekali hihihi.

    Bila dah jumpa dekat shopee, tengok pula harga. Memang murahlah harganya di shopee kalau dibandingkan harga yang aku nampak di Twitter. Прежде чем продолжить оформление заказа, ознакомьтесь с Macam biasa. Tengok semua bagi feedback positif, kita apa lagi terus checkoutlah.

    Lagi murah sebab aku выкупить монеты shopee sebanyak 6,48 ринггитов. Джади тотал акхир ян аку байяр иалах RM 19.42. Harga asal RM 25.90. Мура ке махал? Memang puas hati dengan servis kedai baranganibudanbayi ni. Pos buku pada hari yang sama aku beli. Sebelum pos, siap hantar lagi gambar buku sebelum dimasukkan dalam flyers ninjavan. Пузырьковая пленка тебаль.

    Дуа хари кемудян, буку каламбур селамат сампай. Biasa штатный курьер акан летак дже посылка ками (бака: аку дан соседи по дому) атас лантаи тапи мемандангкан далам посылка ни ада аят аят сучи аль-Коран, штатный ниндзяван зовут аку.Пройдите вручную.

    Наклейка Siap letak atas parcel untuk mengelakkan parcel tersebut dicampak, dilangkah atau dibaling sesuka hati.

    Багагский депан

    Багагский белаканг

    Антара иси иси кандунган далам буку иници. Сетяп сура ада дилетаккан далам курунган менгенай апа. Сенанг нак ружук бил дах тулис сиап сиап макам ту.

    Memang puas hati dengan jenis tulisan yang digunakan. Саиз тулисан пун так кесил дан так бесар. Memang pekat hitam tulisannya.Так пударь каламбур. Memang senang untuk dibaca. Тапи, ада тапинья. Тулисан аят аят сухи аль-Коран ту макам кесил сикит себаб лебих utamakan terjemahannya. Тапи, масих болех дибача. Mungkin sesiapa yang ada masalah rabun akan mengalami sedikit masalah untuk baca sebab kecil.

    Так тахулах кенапа настроение секаранг раса нак мембели буку ХАХАХА. Дуа мингу лепас настроение мембели коклат. Кали ини настроение нак мембели буку. Bukan buku romantik yang selalu diadaptasi ke drama tu, tapi buku sejarah ke agama ke seram ke tak kisahlah janji bukan роман melayu romantik.Dah tak kuasa nak layan роман жанра macam tu hehehe.

    Penuh cart shopee dengan buku buku. Sebelum beli или в корзину, поиск juga review orang lain. Bukan beli buku semberono je. Тапи так болех бели баньяк баньяк секалигус, маху эмпат хари эмпат малам кена бебель денган какак аку. Кена хабискан сату сату бару продолжать бели буку ян лайн.

    Nota jemari: Tengah tunggu tiga buah buku baru hehehe

    Daging Masak Jintan Penuh Aroma Yang Membuka Selera

    Меню дагинг болех диплбагайкан.Ада Ян сука daging digoreng dengan kunyit дан kalau suka меню bersambal tidak kurang enaknya. Sebenarnya masakan янь простой каламбур дах cukup enak seperti daging masak jintan ni. Калау так боле макан дагинг болех ганти аям тапи дагинг лебих сераси.

    DAGING MASAK JINTAN
    Bahan-bahan:
    1 кг daging, dipotong biasa
    Bahan A
    2 суду сербук кетумбар- BELI ONLINE DI SINI
    man jin serbuk
    3 суду сербук.
    1 1/2 суду сербук цзинтан пути
    1 суду кесил лада пути
    1/2 суду кесил сербук лада хитам
    1/2 каван аир асам джава
    4 камча гула
    гарам секукуп раса
    сербук пераса джика суука
    2 суду kunyit-BELI ONLINE DI SINI
    (kalau jintan manis, jintan putih, ketumbar dan lada hitam anda bukan serbuk tapi biji maka ianya kenalah dikisar terlebih dahulu).

    Bahan B
    Bahan dikisar:
    5 ulas bawang putih
    8 ulas bawang merah
    2 inci halia
    2 sudu kunyit hidup
    5 batang serai
    1 ibu jari 9000 lengkuas

    BAHAN C
    1 1/2 каван -2 каван миньяк масак себаб калау миньяк баньяк сенанг масак дан дагинг джади кантик.

    BAHAN D
    3 biji bawang besar - дипотонг булат

    Cara memasak:
    1. Masukkan bahan A dan B.Галлия дан себатикан. Раса сикит апа янь куранг тамбахлах менгикут селера анда. Пасту хендаклах диперап селама 20-30 мин.
    2. Панаскан куали дан масуккан миньяк-кемудиан била миньяк дах бенар-бенар панас масуккан дагинг ян диперап тади.
    3. Галлия рата дан масак дагинг денган апи куат дан седерхана. Била дагинг дах масак дан хампир керинг масуккан баванг бесар. Balik-balikkan дан sebatikan sehingga layu. Sebelum tutup api kalau suka boleh dimasukkan cili padi 10-20 biji. (Cili jangan dipotong cuma buangkan tangkainya.Sebiji sebiji дан rasailah apa yang kurang ditambah. Bila dah agak kering kuahnya дан nampak minyak dah mulai naik semula, tutup api.
    Siap untuk dihidang. Amat sedap dimakan dengan nasi putih panas-panas dan nasi minyak. Кубала.

    Кредит pada pemilik resipi: ida shida

    6 Меню Сахур Ини Сангат Мудах Димасак. Джимат Маса Дан Седап Так Терката

    Ресипи Гулай Аям и Самбал Белакан Ала Наси Как Вок, Меманг Седап!

    Кара Масак Наси Кукус Ян Муда и Так Беркерак

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *