S Tang

^* Кафедра нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037270, Китай 9000 Чжан

^* Отделение нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

ЮВ Инь

^* Отделение нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

XJ Gao

^* Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

WW Shi

^* Отделение нефрологии госпиталя Синьцяо, Третье Военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

Y Wang

^* Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

X Хуан

^* Отделение нефрологии госпиталя Синьцяо , Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

L Wang

^† Институт иммунологии НОАК, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

LY Zou

^† Институт иммунологии НОАК , Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

JH Zhao

^* Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

YJ Huang

^* Отделение нефрологии Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

LY Shan

^‡ Кафедра иммунологии, медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

AS Gounni

^‡ Кафедра иммунологии, Медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

YZ Wu

^† Институт иммунологии PLA, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

JB Zhang

^* Кафедра нефрологии, госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

^* Отделение нефрологии, Госпиталь Синьцяо, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400037, Китай

^† Институт иммунологии НОАК, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, 400038, Китай

^‡ Отделение Иммунология, медицинский факультет, Университет Манитобы, Виннипег, Манитоба, R3E 0T5, Канада

¹ Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Abstract

Все больше данных указывает на то, что аберрантное образование внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET) может вносить вклад в патогенез васкулита (AAV), ассоциированного с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA).Недавние исследования предоставили доказательства того, что новый тип аутоантитела ANCA, антитело против лизосомного мембранного протеина-2 (LAMP-2), может играть патогенную роль в AAV. Ранее мы показали, что образование NET, стимулированное антителами против LAMP-2, содержит аутоантигены и антимикробные пептиды. Настоящее исследование было направлено на определение того, присутствует ли LAMP-2, как новый антиген ANCA, в NETs у пациентов с AAV, влияние антитела против LAMP-2 на скорость апоптоза нейтрофилов и роль аутофагии в анти-LAMP -2 индуцированное антителами образование NET.Образование NET оценивали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии или визуализации живых клеток. Скорость апоптоза нейтрофилов анализировали с помощью сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS). Аутофагия была обнаружена с помощью накопления LC3B и просвечивающей электронной микроскопии. Результаты показали, что усиленное образование NET, которое содержит LAMP-2, наблюдалось в биоптатах почек и нейтрофилах от пациентов с AAV. Скорость апоптоза значительно снизилась в нейтрофилах человека, стимулированных антителом против LAMP-2, и этот эффект ослабили ингибиторы аутофагии 3-метиладенин (3MA) и 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-он ( LY294002).На образование NET, стимулированное антителами против LAMP-2, не влияли бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетон (zVAD-fmk) и некростатин-1 (Nec-1), которые являются ингибиторами апоптоза и некроза, соответственно. , но подавлялся 3MA и LY294002. Более того, доля LC3BI, который был преобразован в LC3BII, значительно увеличился ( P = 0,0057), и массивные вакуолизации, которые проявляли характеристики, типичные для аутофагии, были обнаружены в нейтрофилах, стимулированных антителом против LAMP-2.Наши результаты предоставляют дополнительные доказательства того, что аутофагия участвует в ANCA-индуцированном образовании NET в нейтрофилах человека.

Ключевые слова: антинейтрофильные цитоплазматические антитела, апоптоз, аутофагия, внеклеточные ловушки нейтрофилов, васкулит

Введение

Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA) -ассоциированные васкулиты (AAV) являются группой аутоиммунных заболеваний. инфильтрация нейтрофилов, накопление непогашенного лейкоцитоклаза в периваскулярных тканях и фибриноидный некроз стенок сосудов 1.У пациентов с ААВ часто наблюдается быстро прогрессирующая почечная недостаточность, вызванная серповидным гломерулонефритом (ГН). Было показано, что миелопероксидаза (MPO) и протеиназа 3 (PR3) являются двумя основными антигенами ANCA 2. Аутоантитело к лизосомному мембранному белку-2 (LAMP-2) представляет собой дополнительный подтип ANCA 3,4.

ANCA, которые активируют нейтрофилы через фрагменты Fab и Fc, которые прикрепляются к эндотелиальным клеткам и вызывают повреждение, как полагают, играют прямую роль в патогенезе AAV 5. Каин и его коллеги недавно представили доказательства того, что другой тип аутоантител, анти-LAMP-2 (направленный против белка лизосомальной мембраны-2), может иметь патогенную роль в AAV и молекулярную мимикрию между LAMP-2 и белком бактериальной адгезии FimH 4.Однако распространенность аутоантител к LAMP-2 в AAV остается спорной 6,7. Наши предыдущие данные показали, что антитело против LAMP-2 может активировать нейтрофилы in vitro для высвобождения внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET), которые содержат аутоантигены и антимикробные пептиды 8.

Нейтрофилы являются самой распространенной группой лейкоцитов в кровообращении. , и они имеют очень короткую продолжительность жизни до апоптоза. Нейтрофилы формируют первую линию защиты от вторжения патогенов с несколькими эффекторными механизмами, включая фагоцитоз, высвобождение бактерицидных продуктов и продукцию активных форм кислорода (ROS) 9.Образование NET, также называемое NETosis, представляет собой уникальный, недавно открытый механизм врожденной иммунной защиты, характеризующийся активным высвобождением волокон хроматина, украшенных различными гранулированными белками, во внеклеточное пространство в ответ на бактерии 10. Хотя NET являются бактерицидными и вносят свой вклад в врожденная защита хозяина, чрезмерное образование NET были связаны с патогенезом аутоиммунного заболевания 11. Наши и другие данные продемонстрировали, что NET запускают васкулит и закрепляют аутоиммунный ответ против компонентов нейтрофилов, таких как MPO, PR3 и кателицидин LL37, у пациентов с AAV с 8,12–14 и в моделях на животных 15.

НЕТоз — это сложный процесс, который различается в зависимости от стимула. Хотя регуляция субклеточных событий во время NETosis остается неясной, все больше данных указывает на то, что продукция супероксида, Raf / митоген внеклеточная сигнально-регулируемая киназа (MEK) / активация внеклеточной сигнальной киназы (ERK), аутофагия и цитруллинирование гистонов могут быть вовлечены в образование NET. 16. Принимая во внимание, что LAMP-2 является критическим для аутофагии 17, мы предположили, что связанная с аутофагией передача сигналов может участвовать в индуцированном антителом LAMP-2 образовании NET.

Аутофагия является критическим гомеостатическим механизмом, участвующим в очистке поврежденных органелл или белков и в выживании клеток в периоды истощения питательных веществ, и обеспечивает необходимое снабжение питательными веществами за счет рециркуляции цитозольных макромолекул и органелл 18. Передача сигналов PI3K имеет решающее значение для инициации аутофагии. , тогда как слияние ранних аутофагосом с лизосомами и закисление аутофагосом составляет конечное событие в аутофагии. Напротив, ингибирование PI3K с помощью 3-метиладенина (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-она (LY294002), как предполагается, ингибирует аутофагию 19.

На основании этих результатов мы попытались определить, присутствует ли LAMP-2, как новый ANCA-нацеленный аутоантиген, в NET у пациентов с AAV, и влияние антитела против LAMP-2 на апоптоз нейтрофилов при активации высвобождения NET. Кроме того, мы исследовали роль связанной с аутофагией передачи сигналов в образовании NET, стимулированном антителами против LAMP-2.

Материалы и методы

Субъекты

Пятнадцать пациентов с ААВ, диагностированных в соответствии с определением Чапел-Хилл 20, были набраны из отделения нефрологии госпиталя Синьцяо Третьего военного медицинского университета.Демографические характеристики пациентов с ААВ представлены в таблице. В настоящее исследование были включены периферическая кровь, собранная у этих пациентов и здоровых людей из контрольной группы (HC), а также парафиновые срезы образцов биопсии почек, полученных от шести пациентов с серповидным GN. Все биопсии были рассмотрены и классифицированы опытным нефропатологом на основе пересмотренных критериев серповидного GN. PR3-ANCA и MPO-ANCA оценивали с помощью непрямой иммунофлуоресценции (IIF) (FA-1200-2010; Euroimmun, Singapore) с использованием наборов EUROBlot (DL-1200-6421-3G; Euroimmun) в соответствии с инструкциями производителя.Уровни креатинина (Cr) в сыворотке определяли стандартными методами. Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Синьцяо, и все субъекты предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

Таблица 1

Демографические характеристики субъектов исследования.

Иммунофлуоресцентный анализ биопсий почек

Пункционные биопсии почек пациентов с AAV с серповидным GN ( n = 6) фиксировали и заливали парафином. Затем были приготовлены срезы размером 5 мкм и помещены на предметные стекла. После депарафинации с использованием ксилола, регидратации с использованием градиента этанола и извлечения антигена с использованием цитратного буфера мы обрабатывали образцы блокирующим буфером, а затем флуоресцентно меченными антителами против LAMP-2, MPO или PR3 (все из Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Гистон окрашивали с использованием первичных антител против гистона h4 (Abcam, Гонконг, Китай), а затем флуоресцентно меченных специфических вторичных антител. ДНК окрашивали с использованием 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Beyotime, Шанхай, Китай). Эти образцы были проанализированы с помощью конфокального микроскопа Leica SP5.

Выделение нейтрофилов человека

Нейтрофилы человека выделяли центрифугированием плотности с использованием Polymorphprep ™ (Axis-Shield, Осло, Норвегия). Вкратце, 5 мл крови, содержащей этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), наслаивали на 5 мл Polymorphprep ™.После 35 мин центрифугирования при 500 rcf нейтрофилы отделяли от осадка, обогащенного полиморфноядерными нейтрофилами (PMN). Затем остаточные эритроциты удаляли посредством лизиса эритроцитов. Чистота нейтрофилов обычно составляла ~ 95%, как оценивали по маркировке CD16 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) с помощью цитометрического анализа. Если не указано иное, клетки ресуспендировали в среде RPMI (без фенолового красного) (не использовалась ни телячья, ни человеческая сыворотка) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина; 5 × 10 ⁵ -10 ⁶ нейтрофилов / мл высевали на культуральные планшеты или стеклянные покровные стекла для иммунофлуоресцентного анализа.Инкубации проводили при 37 ° C в присутствии 5% CO ₂ .

Иммунофлуоресценция и количественная оценка образования NET

Нейтрофилы высевали на покрытые лизином предметные стекла в 24-луночных планшетах для культивирования клеток и инкубировали в течение 1 часа для прилипания к покровным стеклам. В экспериментах по стимуляции клетки стимулировали ацетатом форболмиристата (PMA) (100 нМ) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), антителом против LAMP-2 (20 мкг / мл, без азидов) (Abcam ) или изотип-специфическое контрольное антитело (20 мкг / мл, мышиный IgG1 без азидов) (Abcam) на срок до 180 мин.Для экспериментов по ингибированию нейтрофилы предварительно обрабатывали бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетоном (zVAD-fmk) (10 мкМ), некростатином-1 (Nec-1) (10 мкМ), LY294002 (50 мкМ) ( все от Sigma-Aldrich) или 3MA (5 мМ) (InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение 15 мин перед нанесением антитела против LAMP-2. Впоследствии клетки фиксировали и повышали проницаемость. После регидратации физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) при комнатной температуре клетки инкубировали в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° C.Затем образцы инкубировали с меченными флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) антителами против LAMP-2, MPO или PR3. Хроматин окрашивали с использованием кроличьих антител против гистона h4, а затем окрашивали флуоресцентно меченными вторичными антителами козьего против кроличьего иммуноглобулина (Ig) G. ДНК окрашивали с использованием DAPI. Метод количественной оценки образования NET, как сообщалось ранее 12,21. Вкратце, используя объектив × 20, процент высвобождающих нейтрофилы NETs был количественно определен в слепых пробах путем оценки нейтрофилов, демонстрирующих расширенные ядра [ядра без дольчатости и превышающие нормальный средний диаметр окрашивания ДНК (10 мкм)] и высвобождающие волокна ДНК в не менее пяти случайных полей микроскопа.Файлы изображений были проанализированы с помощью программного обеспечения Image pro-Plus версии 6 · 0. Процент NET рассчитывали следующим образом: NET-rate (%) = 100 × количество нейтрофилов, демонстрирующих расширенные ядра и высвобождающих волокна ДНК / общее количество нейтрофилов.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

Свежеочищенные нейтрофилы стимулировали 20 мкг / мл антитела против LAMP-2 или контрольного антитела изотипа в течение до 3 часов, а затем клетки фиксировали в 2,5% глутаральдегиде в течение 2 часов. при 4 ° C. После трехкратной промывки физиологическим раствором образцы дегидратировали с использованием градуированного этанола с последующей серией трет-бутилового спирта, а затем сушили в сушилке для критической точки.Поверхности образцов покрывали слоем платины / углерода толщиной 5 нм с использованием тонкослойного испарителя.

Визуализация живых клеток

Нейтрофилы разбавляли до 2 × 10 ⁶ клеток / мл в культуральной чашке со стеклянным дном для наблюдения живых клеток (NEST, Шанхай, Китай) и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C в присутствии 10 мкг / мл Hoechst 33342 (Beyotime, Шанхай, Китай) и 1 мкМ Sytox green (Invitrogen, Grand Island, NJ, США). Затем клетки обрабатывали антителом против LAMP-2 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 180 мин.Флуоресцентные сигналы были обнаружены и отображены с помощью рабочей станции Leica SP5. Морфологию клеток наблюдали с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК). Клетки контролировали в различные моменты времени, и каждые 3 мин снимали несколько стопок изображений.

Анализ клеточной сортировки с активацией флуоресценции (FACS)

Скорость апоптоза нейтрофилов измеряли с помощью проточной цитометрии (BD FACSCantoII) с использованием набора для обнаружения апоптоза Annexin-V / PI (4Abio, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блот-анализ

Вестерн-блот-анализ проводили на клетках, обработанных в течение 30 мин. В этот момент времени наиболее заметное превращение LC3BI в LC3BII наблюдалось после обработки антителом против LAMP-2. Нейтрофилы осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса с добавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), и остатки клеток удаляли центрифугированием после инкубации лизата в течение 30 минут на льду. Затем 30 мкг белка разделяли на геле для электрофореза в 12% додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE).Затем проводили инкубацию в течение ночи мембран поливинилидендифторида (PVDF) при 4 ° C в антителе против LC3B (1: 3000) (Novus, Литтлтон, Колорадо, США) с последующим зондированием вторичным конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). антитело (1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

После стимуляции нейтрофилы собирали центрифугированием (1500 об / мин в течение 10 мин). Затем осадок клеток фиксировали с использованием 2,5% глутарового альдегида, затем фиксировали с использованием 1% тетроксида осмия, контрастировали уранилацетатом и дубильной кислотой, дегидратировали, заливали в формы, содержащие чистую смолу Спурра, и давали затвердеть при 70 ° C. .После полимеризации образцы были разрезаны на срезы 60 нм и окрашены цитратом свинца.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (s.e.m.). Статистический анализ включал непарный тест Стьюдента t и выполнялся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5. Значения вероятности P <0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Отложение NETs в почках пациентов с AAV с серповидным GN

Чтобы оценить роль NETs в воспалении почек, мы исследовали панель залитых парафином тканевых срезов из биопсии почек от пациентов с AAV с серповидным GN и острым синдромом. ухудшение функции почек ( n = 6).Как и ожидалось, мы обнаружили типичные компоненты NET, которые выглядели как « облачно » или « нитевидные » окрашенные структуры ДНК и совместную локализацию гистонов и гранулярных белков, таких как MPO (,) и PR3 (,), как сообщалось ранее 12. Мы также обнаружили LAMP-2, новый целевой аутоантиген ANCA, наблюдаемый в NET, расположенных в пораженных клубочках () и в интерстиции () биопсий почек от пациентов с AAV с серповидным GN. Однако только слабые сигналы иммунофлуоресценции, положительные для гистона и МПО, наблюдались в почечных тканях от пациентов с AAV с не серповидным GN (,).Наши результаты предполагают, что отложение NET может вносить вклад в формирование серповидной формы у пациентов с быстро прогрессирующим AAV.

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) откладываются в биоптатах почек у пациентов с васкулитом (AAV), ассоциированным с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA). Иммунофлуоресцентный анализ залитых парафином срезов биопсии почек от пациентов с AAV с серповидным гломерулонефритом (GN) или без него. NET идентифицировали по совместной локализации с внеклеточной ДНК (синий), гистонами (красный) и белками нейтрофильных гранул миелопероксидазой (MPO), протеиназой 3 (PR3) или лизосомальным мембранным белком-2 (LAMP-2) (зеленый).(a – c) Совместная локализация аутоантигенов (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в клубочках (обозначенных белой линией). (e – g) Совместная локализация аутоантигенов (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в интерстиции почечных канальцев (обозначена белой линией). (d, h) Совместная локализация MPO (зеленый), гистона (красный) и ДНК (синий) в срезах биопсии почек от пациентов с AAV без серповидного GN.

Повышенное образование NET в периферических нейтрофилах у пациентов с AAV

Kessenbrock et al .12 предположили, что ANCA-индуцированное образование NET участвует в васкулите и хроническом аутоиммунитете у пациентов с AAV. Чтобы оценить образование NET и определить, является ли LAMP-2 совместно локализованным с NET у пациентов с AAV, нейтрофилы периферической крови были изолированы от пациентов с AAV ( n, = 15) и здоровой контрольной группы (HC) ( n = 10), и были затем инкубировали в инкубаторе CO ₂ при 37 ° C в течение 1 часа перед обнаружением NET с помощью флуоресцентной визуализации. Мы обнаружили усиленное образование NET в нейтрофилах пациентов с AAV, поскольку несколько ядер изменили свою типичную дольчатую структуру и высвободили волокна ДНК () по сравнению с нейтрофилами HC ().Мы обнаружили, что 19 · 57 ± 1 · 051% нейтрофилов от пациентов с AAV продуцировали NET по сравнению с 12 · 86 ± 1 · 528% нейтрофилов HC (, ** P <0,01). Затем мы попытались определить, присутствовали ли нацеленные на ANCA аутоантигены PR3, MPO и LAMP-2 в СЕТИ пациентов с AAV. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что LAMP-2, MPO и PR3 совместно локализованы во внеклеточных волокнах хроматина от пациентов с AAV (). Как недавно сообщалось, своеобразная структура NETs способствует загрузке нейтрофильных цитоплазматических антигенов в миелоидные дендритные клетки (mDC) и индуцирует продукцию ANCA и аутоиммунитет 22.Эти данные предполагают, что внутриклеточные аутоантигены, высвобождаемые при НЕТозе, могут вызывать составляющие нейтрофилов, поскольку эндогенные сигналы опасности подвергают иммунную систему опасности и нарушают иммунную толерантность.

Высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET) в нейтрофилах периферической крови пациентов с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA), ассоциированными с васкулитом (AAV). (a, b) Флуоресцентная визуализация образования NET нейтрофилами, выделенными от пациентов с AAV (a) и здоровых контролей (HC) (b) после инкубации в течение 1 часа in vitro и окрашивания на ДНК с использованием 4 ‘, 6-диамидино-2 -фенилиндол (DAPI).(c) Количественное определение NET-образующих нейтрофилов от пациентов с HC или AAV с помощью флуоресцентного микроскопического анализа (** P <0,01). (d) Иммунофлуоресцентный анализ AAV-NET, идентифицированных путем совместной локализации с внеклеточной ДНК (синий), гистонами (красный) и белками нейтрофильных гранул миелопероксидазой (MPO), протеиназой 3 (PR3) или лизосомальным мембранным белком-2 (LAMP-2). ) (зеленый).

Анти-LAMP-2 антитело способствует образованию NET в нейтрофилах

Человеческое LAMP-2 антитело представляет новый подтип ANCA, хотя его роль в AAV остается спорной 23.В отличие от MPO и PR3, человеческий LAMP-2 обильно экспрессируется как на нейтрофильных, так и на эндотелиальных поверхностях и перемещается между лизосомами и клеточной мембраной; таким образом, LAMP-2 напрямую доступен для циркулирующих антител 24. Kessenbrock et al . 12 сообщили, что ANCA, которые специфичны для MPO и PR3, индуцируют праймированные нейтрофилы человека с образованием NET in vitro ; поэтому мы исследовали, имеют ли антитела против человеческого LAMP-2 такой же эффект на незапраймированные нейтрофилы.Некоторые нейтрофилы, выделенные из HC, стимулированного h5B4 (20 мк / мл), моноклональным IgG против человеческого LAMP-2, в течение 180 минут, проявляли типичные характеристики NET, включая «морфологически измененные ядра» и «сетчатые структуры», по сравнению с нейтрофилы, обработанные изотип-специфическим контрольным антителом, которые были визуализированы с помощью SEM () и флуоресцентной микроскопии (). h5B4 (20 мкг / мл) вызывал образование NET из 25,5 ± 1,88% этих нейтрофилов по сравнению с 11,7 ± 0/94% для изотип-специфических антител (, *** P <0,001) .Для дальнейшего изучения динамического процесса образования NET, стимулированные h5B4 нейтрофилы отслеживали с помощью визуализации живых клеток с использованием не проницаемой для клеток ДНК-красителя Sytox green вместе с проницаемой для клеток ДНК-красителя Hoechst33342. Со временем NET, характеризующиеся деконденсацией внутриклеточного хроматина с последующим распадом плазматической мембраны, были обнаружены в нейтрофилах, обработанных h5B4 ().

Нейтрофилы, обработанные антителом против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2), высвобождают внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET).(a, b) Здоровые контрольные (HC) нейтрофилы инкубировали с h5B4 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 180 мин. (а) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) анализ образования NET на основе появления уплощенных клеток, образующих множество выступов мембраны. (b) Флуоресцентный микроскопический анализ образования NET, основанный на появлении увеличенных ядер, высвобождающих внеклеточные волокна ДНК, окрашенные 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). (c) Количественная оценка NET-образующих нейтрофилов (*** P <0,001).(d) Нейтрофилы, стимулированные h5B4, контролировались каждые 3 минуты в течение 180 минут с помощью визуализации живых клеток по трем параметрам: морфология с использованием дифференциального контрастирования интерфейса (DIC), хроматин с использованием маркера проницаемой для клеток ДНК Hoechst 33342 (синий) и внеклеточной ДНК. с использованием непроницаемого для клеток ДНК-красителя Sytox Green (зеленый). Показаны репрезентативные моменты времени.

Антитело против LAMP-2 ингибирует спонтанный апоптоз нейтрофилов

Для поддержания количества гомеостатических клеток старые нейтрофилы постоянно умирают в результате апоптоза 25.Сообщалось, что апоптоз нейтрофилов в AAV не регулируется, что способствует накоплению нейтрофилов в тканях AAV 26. Таким образом, мы оценили влияние антитела против LAMP-2 на скорость спонтанного апоптоза in vitro нейтрофилов. . Скорость апоптоза нейтрофилов у здоровых людей, получавших h5B4 или изотип-специфическое контрольное антитело, количественно определяли с помощью FACS через 24 часа в культуре. Результаты показали значительно более низкую скорость апоптоза в нейтрофилах, обработанных h5B4, по сравнению с контрольными изотипами (,, *** P <0,001).Этот результат согласуется с открытием, что антитела против LAMP-2 активируют нейтрофилы с образованием NET, а не подвергаются апоптозу. Интересно, что мы обнаружили, что предварительная обработка нейтрофилов 3MA или LY294002, которые использовались в качестве специфических ингибиторов аутофагии, ослабляла этот эффект h5B4 за счет повышения скорости апоптоза нейтрофилов, обработанных h5B4 (,, * P <0,05, ** P <0,01).

Антитело против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2) ингибирует спонтанный апоптоз нейтрофилов.Апоптотические клетки детектировали с помощью проточной цитометрии с использованием аннексина V-Alexa Fluor 488 / PI. (а) Нейтрофилы инкубировали с изотип-специфическим контрольным антителом или h5B4 в течение 24 часов. (b) Нейтрофилы предварительно обрабатывали 3-метиладенином (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-оном (LY294002) (LY294002) в течение 15 минут, а затем стимулировали h5B4 в течение 24 часов. (c) Показаны проценты апоптозных нейтрофилов (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными h5B4).

Образование NET, индуцированное антителом против LAMP-2, включает аутофагию

Для дальнейшего изучения возможной роли аутофагического аппарата в высвобождении NET, индуцированном антителом против LAMP-2, 3MA и LY294002 были использованы в качестве ингибиторов PI3K. Предварительная обработка (15 мин) нейтрофилов HC этими агентами перед добавлением h5B4 значительно снизила процент клеток, выделяющих NET (,). Однако эти индуцированные h5B4 NET были нечувствительны к zVAD-fmk, который предотвращает апоптоз, и Nec-1, ингибитору некроза через путь киназы RPI1 ().В совокупности эти данные предполагают, что аутофагический аппарат участвует в индуцированном антителом LAMP-2 образовании NET.

Передача сигналов фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) необходима для индуцированного антителами образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET), индуцированного антителом против лизосомного мембранного белка-2 (LAMP-2). (а) Предварительная обработка 3-метиладенином (3MA) или 2-морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-оном (LY294002) в течение 15 минут предотвращает высвобождение NET из нейтрофилов, обработанных h5B4, в течение 180 минут. NET обнаруживали совместным окрашиванием ДНК (синий) и миелопероксидазой (МПО) (зеленый) и визуализировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.(b) Влияние предварительной обработки 3MA, LY294002, бензилоксикарбонил-Val-Ala-Asp (OMe) -фторметилкетон (zVAD-fmk) или некростатином-1 (Nec-1) на процентное содержание нейтрофилов, высвобождающих NET, стимулированных -h5B4 ( * P <0,05; ns = несущественно по сравнению с клетками, обработанными h5B4).

Более того, активация аутофагии в нейтрофилах, обработанных h5B4, отслеживалась на основании локализации иммунофлуоресценции LC3B. Во время раннего периода индукции аутофагии LC3B перемещается из цитоплазмы во вновь сформированные аутофагосомы 27.В течение 30 минут после стимуляции h5B4 мы наблюдали точечные структуры LC3B, которые типичны для аутофагии, и этот эффект был уменьшен 3MA (). Способность h5B4 стимулировать аутофагию была дополнительно продемонстрирована с помощью иммуноблоттинга для LC3B (** P <0,01). Сообщалось, что многие типы клеток демонстрируют массивную вакуолизацию во время связанной с аутофагией гибели клеток 28. ТЕМ-анализ нейтрофилов выявил наличие массивной вакуолизации, типичной для аутофагии, когда нейтрофилы обрабатывались h5B4 в течение 30 минут ().Эти вакуоли не наблюдались в нейтрофилах, обработанных изотип-специфическими антителами, которые характеризуются многодольчатыми ядрами и различными типами гранул ().

Антитело против лизосомального мембранного протеина-2 (LAMP-2) способствует аутофагии нейтрофилов. (а) Иммунофлуоресцентное окрашивание на LC3B в нейтрофилах, обработанных h5B4 или изотип-специфическим контрольным антителом в течение 30 мин. Аутофагию оценивали на основании образования LC3B-позитивных аутофагосом. ДНК метили с использованием 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий), и LC3B детектировали с использованием поликлонального антитела против LC3B (красный).(b) Анализ и количественная оценка превращения LC3BI в LC3BII в нейтрофилах, обработанных изотипическим контрольным антителом (дорожка I) или h5B4 (дорожка II) в течение 30 минут, и эффекта 3-метиладенина (3MA) (дорожка III) и 2- морфолин-4-ил-8-фенилхромен-4-он (LY294002) (полоса IV) на клетках, обработанных h5B4, по оценке иммуноблоттинга на LC3B (** P <0,01 по сравнению с клетками, обработанными h5B4). (c, d) Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) показывает массивную вакуолизацию нейтрофилов, обработанных h5B4 в течение 30 минут (c), но не клеток, обработанных контрольным изотипом антител (d).

Обсуждение

НЕТоз играет важную роль в воздействии аутоантигенов на иммунную систему и вызывает деструктивный некротический васкулит при различных состояниях, таких как системная красная волчанка (СКВ) 29 и AAV 12. LAMP-2 является новой мишенью для ANCA наряду с более известные цели PR3 и MPO. LAMP-2 является основным компонентом лизосомальной мембраны, которая обнаруживается не только выстилающей гранулы нейтрофилов, но также и на поверхности клетки, и играет роль в аутофагии 23.

Это исследование является первым, демонстрирующим, что образование NET, индуцированное LAMP-2 ANCA, включает запуск аутофагического аппарата. Наши экспериментальные данные показывают, что антитело против LAMP-2 ингибирует спонтанный апоптоз и активирует аутофагию нейтрофилов, активируя высвобождение NET in vitro в нейтрофилах, и что ингибирование передачи сигналов PI3K снижает аутофагию и препятствует высвобождению NET. Мы также предоставляем доказательства того, что усиленные NET откладывались в биопсиях почек и высвобождались периферическими нейтрофилами у пациентов с AAV, и что LAMP-2 совместно локализовался в NET у пациентов с AAV.

Нейтрофилы могут высвобождать АФК и протеазы в тканевое микроокружение, приводя к воспалению и повреждению тканей, которые, как считается, служат критическими эффекторными клетками, ответственными за сосудисто-некротическое воспаление при AAV. При культивировании in vitro эти клетки подвергаются спонтанному апоптозу в отсутствие достаточных концентраций факторов выживания нейтрофилов 30. Нейтрофилы удаляются из тканей посредством некроза или апоптоза с последующим фагоцитозом марофагии 31.Дефекты в путях апоптоза могут приводить к сохранению аутореактивных Т- или В-клеток и развитию аутоиммунных заболеваний, включая AAV 32. В последние 20 лет апоптоз и вторичный некроз считались основными источниками аутоантигенов в патогенезе системных аутоиммунных заболеваний. Поскольку НЕТоз представляет собой эффективную иллюстрацию механизма, с помощью которого внутриклеточные аутоантигены подвергаются иммунным ответам, НЕТоз недавно вызвал повышенный интерес к AAV 33,34.Сети, состоящие в основном из внутриклеточных и внутриядерных материалов, могут быть потенциальными аутоантигенами для иммунной системы 35 и напрямую повреждать эндотелиальные клетки сосудов 36. Повышенное образование NET наблюдалось при СКВ 37, ревматоидном артрите (РА) 35, дерматомиозите (СД) 38 и AAV 12 , среди прочего. Наше исследование показывает, что усиленные NET откладывались в биоптатах почек пациентов с AAV и высвобождались периферическими нейтрофилами, что является феноменом, который обычно подвергает внутриклеточные аутоантигены иммунной системе, предполагая их патогенную роль в индукции воспаления при AAV.Более того, эти волокнистые отложения ДНК, которые содержат целевые аутоантигены LAMP-2, MPO и PR3, которые делают структуры NET высокоиммуногенными, предназначены для активации плазматических дендритных клеток (pDC) и аутореактивных B-клеток в Toll-подобном рецепторе 9-зависимом образом, как сообщалось ранее 39,40.

Апоптоз и некроз — две основные формы смерти нейтрофилов. Кроме того, аутофагия недавно была причастна к гибели нейтрофильных клеток 41. Аутофагия — это хорошо законсервированный, существенный внутриклеточный процесс деградации, который, как известно, регулирует обмен белков и органелл, и который составляет решающий механизм врожденного иммунитета во многих типах клеток 42, 43.Аутофагия также участвует в адаптивных иммунных ответах, играя ключевую роль в процессинге антигена для презентации главного комплекса гистосовместимости (MHC) и в развитии, выживании и пролиферации лимфоцитов, которые, по-видимому, регулируются ненормально при аутоиммунных заболеваниях 44. В этом исследовании zVAD-fmk и Nec-1 использовались в качестве ингибиторов апоптоза и некроза соответственно, тогда как 3MA и LY294002 использовались в качестве ингибиторов PI3K. Мы обнаружили, что ни ингибирование каспаз с помощью zVAD-fmk, ни ингибирование киназ RIP1 с помощью Nec-1 не влияет на образование NET, индуцированное антителом против LAMP-2.Эти результаты согласуются с НЕТозом, различающимся между апоптозом и некрозом не только морфологически, но и биохимически. Однако как 3MA, так и LY294002 значительно ингибировали индуцированное антителом LAMP-2 образование NET. Таким образом, мы предполагаем, что для высвобождения этих внеклеточных структур необходим механизм аутофагии. Это предположение согласуется с недавним сообщением, демонстрирующим, что ингибирование аутофагии в нейтрофилах, обработанных PMA, предотвращает NETosis и ведет к апоптической гибели клеток 45.Однако ингибирование передачи сигналов PI3K не подавляло полностью индуцированное антителом LAMP-2 образование NET до контрольных уровней. В основе НЕТоза должны лежать другие регуляторные механизмы. Существует по крайней мере три различных типа аутофагии, включая макроаутофагию, шаперон-опосредованную аутофагию (CMA) и микроаутофагию. Макроаутофагия, обычно называемая просто аутофагией, является предметом нашего исследования. CMA и микроаутофагия не представляли сложности в этом исследовании и должны быть изучены в дальнейших исследованиях. Генетические данные о механизмах повышенного образования NET у пациентов с AAV отсутствуют.Поэтому здесь потребуются большие усилия.

В заключение, наши данные указывают на то, что NET образуются во время аутоиммунных атак AAV, и предполагают связь между высвобождением NET, индуцированным анти-LAMP-2-антителами, и передачей сигналов, связанной с аутофагией. Необходимы дальнейшие исследования для оценки аутофагического механизма in vivo в NET-образующих нейтрофилах пациентов с AAV и для изучения точных сигнальных путей, ведущих к ANCA-стимулированному НЕТозу.

Благодарности

Авторы благодарят всех пациентов и здоровых добровольцев, принявших участие в этом исследовании.Мы благодарим нашего сотрудника г-жу Цзинь Пэн за помощь в конфокальной микроскопии и анализе изображений живых клеток. Мы также благодарим г-жу Сяолань Фу за ее помощь в анализе FACS. Это исследование было поддержано Национальным научным фондом Китая (30971366), Проектами международного сотрудничества Чунцинского комитета по науке и технологиям (CSTC201110004) и Проектом клинических исследований Третьего военно-медицинского университета (2011XLC37).

Вклад авторов

J.Б.З. принимал участие во всех аспектах концепции, дизайна и направления исследования и обеспечивал окончательное одобрение представленной рукописи. Разработкой исследования занимались J. B. Z., A. S. G. и Y. Z. W. J. B. Z., S. T., L. Y. S., L. W. и S. W. Y. принимали участие в сборе данных, анализе данных и интерпретации результатов. S. T., Y. Z., X. J. G., W. W. S. и L. Y. Z. провели лабораторные испытания. Y. W., X. H., J. H. Z. и Y. J. H. участвовали в клиническом анализе. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки