Главные герои «Недоросль» характеристика положительных и отрицательных персонажей комедии Фонвизина

Комедия «Недоросль» была создана Д. И. Фонвизиным в 1781 году. Центральной проблемой произведения выступает порицание дворянского воспитания тех времен. Пьеса содержит признаки классического стиля. Типичной литературным приемом является употребление говорящих имен и фамилий, которые четко отражают характер персонажа. Название пьесы отражает суть указа Петра I, где и оговаривалась невозможность дворян, не имеющих образования, служить и жениться. Актуальность проблематики произведения часто используется при написании сочинений или творческих работ.

Характеристики героев «Недоросль»

Главные герои

Митрофанушка	В образе Митрофана, автор высмеивает грубость, невежество и застой российского дворянства. Главному герою шестнадцать лет от роду, живет он с родителями. Митрофан единственный ребенок в семье. Он абсолютно необразован. Все только хвалят Митрофанушку за отсутствие стремления к учебе. Персонаж предстает перед читателем как избалованный и не уважающий других молодой человек. Он не уважает собственного отца, льстит и пользуется расположением матери. Подробная характеристика Митрофана.
Стародум	В “Недоросле” герой Стародум – это дядя и опекун Софьи. Его имя указывает на поколение придворных людей, которые несли свою службу честно и без заискивания перед «сильными мира сего». Он говорит словами автора. Персонаж характеризуется искренним прямодушием и отрицанием всякой несправедливости. Человек, обладающий полномочиями и властью не должен пренебрегать правами других людей – вот основной моральный принцип героя. Положительный герой, который выступает выразителем авторского замысла. Подробная характеристика Стародума.
Простакова	Узловой отрицательный герой. Показана как необразованная и невежественная баба. Она концентрирует в своих руках власть в семье. Единственный человек, к которому она питает добрые чувства — ее сын. Основной характеристикой ее образа является безумное, и даже животное чувство любви к сыну. Она уверена в том, что все, что хорошо Митрофану – выгодно, а остальное – плохо. По ее мнению способ, которым достигается желаемое, не имеет особой важности, главное – результат. Подробная характеристика Простаковой.
Правдин	Государственный служащий, который отправлен с целью проверки истинного положения дел в имении Простаковых. Человек порядочный и честный. Он отмечает все признаки произвола и самодурства. Дело Простаковых заботит его не только как дело государственной важности. Герой желает пресечь помещичий произвол. Правда возьмет верх и имение у жестокой и деспотичной жены будет изъято. Подробная характеристика Правдина.

Второстепенные персонажи

Няня Еремеевна	Образ Еремеевны, няни Митрофана олицетворяет пагубное влияние крепостного права на дворовых слуг. Еремеевна сорок лет служит Простаковым — Скотининым. Она самоотверженно предана хозяевам, привязана к их дому как рабыня. У няни чрезвычайно выработано чувство долга. Она переживает за Митрофана, хотя и многое терпит от него.
Скотинин	Второй крайне отрицательный персонаж, из перечня образов. Фамилия и единственная страсть — свиньи говорят сами за себя. Эти черты придают образу некоторое сходство с животным. Он вырос в семье, которой было чуждо просвещение и моральные ценности. Персонаж характеризуется некоторой отсталостью, хотя и обладает сообразительностью от природы. Подробная характеристика Скотинина.

Комедию можно считать собранием анекдотичных ситуаций и рассказов той поры, которые отражают уровень невежества дворянского сословия. Список героев представлен как противопоставление светлого темному. Анализ положительных персонажей не дает ярких эмоций, но выражает авторскую позицию. Основные конфликты отражают борьбу здравого смысла с невежеством. Перечень характеристик действующих лиц пьесы не утратил своей актуальности и в наши дни. Проблематика произведения часто используется при написании сочинений или творческих работ. Особенностями произведения является то, что благодаря собирательному образу героя, читатель может представить себе трагичность и комичность ситуации.

Посмотрите, что еще у нас есть:

Тест по произведению

Доска почёта

Чтобы попасть сюда — пройдите тест.

• Матвей Буйволов

  16/18

• Ярослав Кузнецов

  18/18

• Повелитель Тьмы

  16/18

• Алина Майбургх

  13/18

• Руслан Дашковский

  18/18

• Юлия Юрьева

  16/18

• Артемий Сергеев

  13/18

• Ангелина Чаркина

  15/18

• Вероника Качан

  18/18

• Eva Kendel

  18/18

Сочинение: Характеристика Митрофана в пьесе «Недоросль» (+ таблица)

(345 слов) Произведение Дениса Ивановича Фонвизина «Недоросль» можно назвать лучшей поучительной комедией в истории русского классицизма. Благодаря системе образов в пьесе, читатель способен глубже понять проблемы необразованности, ханжества, воспитания и другие недостатки дворянского общества.

При помощи образа Митрофана, главного представителя злонравного дворянства, раскрывается тема безграничной, слепой материнской любви и вседозволенности. От этого и растут корни всех составляющих характера героя. 

Митрофан, как и его мать, — невежественный персонаж. Он ленится учиться, ему кажется скучным и бесполезным процесс обучения. Его учителя — Цифиркин, Кутейкин и Вральман — за три года так и не смогли научить сына Простаковой считать, писать, не говоря уже о серьезных пластах знаний в гуманитарных науках. В связи с необразованностью, герой не способен красиво и правильно излагать мысли. Напротив, его речь переполнена искаженными словами и бранной лексикой. Крестьянку Еремеевну он, к примеру, называет «стара кляча», а в конце произведения и вовсе бранит собственную мать. Но Митрофан не только глупый и некультурный, он еще и жестокий. Он неуважительно относится к членам семьи, особенно, к прислуге, что часто поощряется матушкой. 

Кроме того, младший Простаков обделен чувством гражданского долга, патриотизма и уважения к родине. В его возрасте положено думать о предстоящей службе. Ведь с 16 лет всех юношей призывали на службу. По пьесе Митрофану уже было 15 лет. Но герой думает лишь о праздном времяпрепровождении и свадьбе: «Не хочу учиться, хочу жениться». Осознавая свою нравственную незрелость и невежество, персонаж не сомневается в своем решении относительно Софьи, он, напротив, очень высокого о себе мнения, как и его матушка. Проживая свое детство и отрочество в условиях постоянного поощрения, невмешательства и потакания всем его прихотям, герой вырос изнеженным и избалованным мальчиком. Поэтому для него считается обычным делом назвать учителя «гарнизонной крысой». Ведь за такой ругательство его никто не накажет. 

В образе Митрофана сосредоточились все черты загнивающего дворянства, о котором писал Лермонтов в произведении «Дума»: «Печально я гляжу на наше поколение…». Таких людей не интересовало будущее страны, они не видели смысла в образовании, не участвовали в развитии государства. Так, Фонвизин, наблюдая за представителями нравственно обнищавшего высшего общества, осознавал потенциальную проблему отсутствия благоразумия подрастающих молодых людей. Именно поэтому образ сына Простаковой стал ключевым акцентом в пьесе «Недоросль».  

Черты характера Митрофана	Цитаты
Дурное воспитание и дурной пример	«…Лишь стану засыпать, то и вижу, будто ты, матушка, изволишь бить батюшку
Грубость и агрессия	«…Ну, еще слово молви, стара хрычовка! Уж я те отделаю…»
Подлость и желание наябедничать	«…я опять нажалуюсь матушке, так она тебе изволит дать таску по-вчерашнему…»
Неуважение к родителям	«…Да отвяжись, матушка, как навязалась…»
Медлительность и застой	..Мне очень мило, что Митрофанушка вперед шагать не любит.
Бесперспективность и невежество	«…Ну, что для отечества может выйти из Митрофанушки, за которого невежды-родители платят еще и деньги невеждам-учителям?..»
Слабость характера и умение манипулировать чувствами матери	«…Вить здесь и река близко. Нырну, так поминай как звали…»
Лень	«…Я дал бы себе ухо отнести, лишь бы этого тунеядца прошколить по-солдатски…»
Изнеженность и избалованность	…пока Митрофанушка еще в недорослях, пота его и понежить; а там лет через десяток, как войдет, избави Боже, в службу, всего натерпится…

Автор: Полина Борискина

«Недоросль»: проблематика — Kratkoe.com

Автор J.G. На чтение 3 мин Обновлено 26 ноября, 2016

Какие проблемы поднимает Фонвизин в комедии «Недоросль» Вы узнаете в этой статье.

«Недоросль»: проблематика

Проблемы поднятые в комедии «Недоросль»:

1. Каким должен быть истинный дворянин — и отвечает ли русское дворянство своему назначению?

2. Необходимость просвещения, образования — отсутствие их..

3. Бесправие крестьян и произвол помещиков.

Каждая из указанных проблематик рассматривается через призму идей просвещения. Фонвизин, обостряя внимание на недостатках эпохи через приемы комического, делает ударение на необходимости менять традиционные, устаревшие, давно неактуальные устои, которые затягивают людей в болото «злонравия», глупости, уподобляя их животным.

Проблема воспитания в комедии «Недоросль»

Проблема воспитания приобретала в представлении Фонвизина государственное значение, ибо в правильном воспитании коренился единственный надёжный, по его мнению, источник спасения от грозящего обществу зла – духовной деградации дворянства.

Воспитание должно дать «прямую цену учености», пробудить гуманные, человеко­любивые чувства, способствовать общему улуч­шению нравов.

«Недоросль» проблема крепостного права

Тема бесправие крестьян и произвол помещиков обозначена писателем уже в первом действии. Первая реплика Простаковой : “Кафтан весь испорчен. Еремеевна, веди сюда мошенника Тришку. Он, вор, везде его обузил” — вводит нас в атмосферу произвола помещичьей власти. Все дальнейшие пять явлений посвящены именно показу этого произвола.
Так начинается “Недоросль”. Главный конфликт социально-политической жизни России — произвол помещиков, поддержанный высшей властью, и бесправие крепостных — становится темой комедии. Драматическим конфликтом “Недоросля” является борьба прогрессивно настроенных передовых дворян — Правдина и Стародума — с крепостниками — Простаковыми и Скотининым.
Рабство, а не воспитание развращает и растлевает самих помещиков, — делает второй вывод Фонвизин. Драматург сурово и обличительно заявляет: русские дворяне превратились в Скотининых, утративших честь, достоинство, человечность, стали жестокими палачами окружающих их людей и всесильными тиранами и паразитами только вследствие крепостного права. Отсюда демонстрация скотининской природы тех, кто именует себя “благородным сословием”, — Простаковой, ее мужа, ее сына, ее брата. Рабовладельцы не только превратили своих крестьян в “тяглый скот”, но и сами стали гнусными и презренными холопами.
Главным намерением Фонвизина в “Недоросле” и было показать все действия, поступки, мысли Простаковых и Скотинина, всю их мораль и интересы в социальной обусловленности. . Они порождены крепостным правом, утверждает Фонвизин. Вот почему от первого до последнего акта тема крепостного права пронизывает все произведение.

Теперь Вы знаете какова проблематика комедии Д.И.Фонвизина «Недоросль» и сможете написать свое сочинение по данной теме.

Говорящие фамилии в произведениях Д.И. Фонвизина «Недоросль» и А.С. Грибоедова «Горе от ума»

В процессе исследовательской работы по литературе «Говорящие фамилии в произведениях Д.И. Фонвизина «Недоросль» и А.С. Грибоедова «Горе от ума» ученицей 9 класса была поставлена цель исследовать использование «говорящих» фамилий в произведениях русских писателей конца XVIII – начала XIX вв., на примере текстов Фонвизина «Недоросль» и Грибоедова «Горе от ума».

Подробнее о проекте:

В предложенном исследовательском проекте по литературе «Говорящие фамилии в произведениях Д.И. Фонвизина «Недоросль» и А.С. Грибоедова «Горе от ума» автором приводится изучение теоретической информации об ономастике и «говорящих» фамилиях в литературе, рассматривается творчество писателей, которые использовали прием «говорящих» фамилий в характеристике образов героев произведений.

Представленная работа о значении фамилий в литературе содержит анализ «говорящих» фамилий в произведениях Д.И. Фонвизина «Недоросль» и А.С. Грибоедова «Горе от ума», изучает их значение, способ образования и определяет, какую роль «говорящие» фамилии играют в характеристике героев.

Оглавление

Введение
1. «Говорящие» фамилии в литературе.
1.1 Определение понятия «говорящие» фамилии.
1.2 История появления «говорящих» фамилий в XVIII-XIX вв.
1.3 Фамилии в литературе.
1.4 Писатели, использовавшие художественный приём «говорящих» фамилий.
2. Материалы и методы исследования.
2.1 «Говорящие фамилии» в классицизме.
2.2 Говорящие фамилии в произведении «Недоросль» Д.И.Фонвизина. 2.3 Говорящие фамилии в произведении «

Горе от ума» А. С. Грибоедова.
2.4 Мои методы исследования : видеоопрос и листы опроса обучающихся 8-9 классов МБОУ «Харинская ООШ».
Заключение
Приложение

Введение

Литература – это письменная форма искусства, совокупность художественных произведений. Она играет большую роль в развитии культуры человечества. Она является культурным стержнем многих народов.

Существуют несколько литературных направлений. Основные – это классицизм, сентиментализм, романтизм, реализм и модернизм. Одной из черт классицизма является такая особенность, как «говорящие фамилии». Главным понятием, на котором будет основано моё исследование, является термин « говорящие» фамилии».

Актуальность. Данная тема становится особо актуальной в 8-9 классах, так как изучение классики 19 века невозможно без использования данного термина.

Выбранная мнойтема актуальна ,так как помогает современному школьнику через «говорящие» фамилии увидеть сущность героя, понять его характер.

Проблема. Как с помощью «говорящих» фамилий автор в своих произведениях выражает субъективное отношение к созданным персонажам? Как герои с «говорящими » фамилиями помогают автору раскрыть идейный замысел своего произведения. Рассмотрим данную проблему на примере творчества Фонвизина „Недоросль” и Грибоедова „Горе от ума”.

Гипотеза. Я считаю, что «говорящие» фамилии — это отличительный приём для выражения ,как положительных , так и отрицательных образов персонажей, которые помогают увидеть сущность и характер героя с первых страниц произведения.

Объект — произведения Фонвизина „Недоросль” и Грибоедова „Горе от ума”.

Предмет — «говорящие» фамилии в произведениях Фонвизина „Недоросль” , Грибоедова „Горе от ума”.

Цель: Исследовать использование «говорящих» фамилий в произведениях русских писателей конца XVIII – начала XIX вв., на примере текстов Фонвизина „Недоросль” и Грибоедова „Горе от ума”.

Задачи:

1. Изучить литературу по данному вопросу и дать краткое историческое описание появлению «говорящих» фамилий.
2. Выявить и отобрать писателей, которые использовали «говорящие» имена и фамилии.
3. Проанализировать использование и роль «говорящих» фамилий и имён в произведениях Фонвизина „Недоросль” и Грибоедова „Горе от ума”.
4. Сделать вывод, составить классификацию «говорящих» фамилий.
5. Провести опрос среди обучающихся 8-9 классов Харинской школы на тему «говорящих» фамилий и проанализировать результаты опроса, предоставив их в виде диаграммы.
6. Доказать или опровергнуть гипотезу.
7. Представить конечный продукт в виде презентации.

Практическая значимость: Практическая значимость этого проекта заключается в том, что конечный продукт ( презентацию ) можно использовать на уроках литературы в 8-9 классе или на внеурочной деятельности.

Перейти к разделу: 2. История возникновения «говорящих» фамилий

. 2. Заполните таблицу по комедии Д. И.Фонвизина «Недоросль». Определите какому герою принадлежат цитаты из текста. На основе таблицы и текста составьте характеристику главных героев, определите значение имени (прием говорящие фамилии).

швондер — пролетарий, «выбранный на заседании жилтоварищества новый глава домкома». автор представляет его как человека, «у которого на голове возвышалась на четверть аршина копна густейших вьющихся волос». несмотря на активное участие в сюжете, этот персонаж не получает развернутой характеристики. он представлен в повести схематически. ш. не человек, он — «общественное лицо», один из «товарищей». автор делает акценты на его ненависти к классовым врагам, то есть к профессору преображенскому и доктору борменталю. во время своего визита в шестой главе он разговаривает с профессором со «спокойным злорадством». и когда филипп филиппович невольно вышел из себя, «голубая радость разлилась по лицу швондера».          в философии ш. краеугольным камнем является документ, бумажка. «документ — самая важная вещь на свете.» — говорит он профессору преображенскому и сильно возмущается, когда преображенский сгоряча называет их идиотскими. «довольно странно, профессор, — обиделся швондер, — как это так вы документы называете идиотскими? я не могу допустить пребывание в доме бездокументного жильца, да еще не взятого на воинский учет милицией. а вдруг война с империалистическими хищниками? «. в этом и есть весь ш., в этом мораль пролетариата, преклоняющегося перед властью, верящего только в силу законов, нормативов, документов, агрессивного и . ему не режет слух откровенная глупость и нелепость составленного удостоверения личности шарикова, которое профессор, светила мировой науки, образованный, тонкий человек не может не признать бредом. ему не важны масштабы открытия, сделанного профессором преображенским, он не понимает, что филипп филиппович совершил чудо, подобно творцу создав человека. шариков для него лишь очередной жилец, единица общества, интересующий его только с практической точки зрения. «что же, дело не сложное. пишите удостоверение, гражданин профессор. что так, мол, и так, предъявитель сего действительно шариков полиграф полиграфович, зародившийся в вашей, мол, квартире.» в противостоянии профессора преображенского и домкома — швондера отражение основного конфликта повести, конфликта между двумя противостоящими социально-этическими классами.

Фонвизин недоросль анализ произведения таблица. Анализ произведения Д.И

Бессмертная комедия Д. И. Фонвизина «Недоросль» была и остается одним из актуальнейших произведений русских классиков. Широта взглядов писателя, его глубокие убеждения о пользе образования и просвещения, нашли отражение в создании этого гениального произведения. Предлагаем ознакомиться с кратким анализом произведения по плану. Данный материал может быть использован для работы на уроке литературы в 8 классе, для подготовки к ЕГЭ.

Краткий анализ

Год написания – 1782 г.

История создания – Замысел комедии возник у писателя после возвращения из – за границы, под влиянием просветительских взглядов зарубежной страны.

Тема – Основной темой «Недоросля» является просвещение и образование, воспитание нового поколения в духе новых веяний времени и политических преобразований.

Композиция – комедия выстроена по всем правилам жанра, в ней соблюдены три составляющих – единство действия, места и времени. Состоит из пяти действий.

Жанр – Пьеса – комедия, яркое и живое повествование, не содержащее трагических эпизодов.

История создания

В «Недоросле» анализ произведения предполагает раскрытие темы, основную мысль комедии, ее суть и идею.

Сначала определим смысл названия. В восемнадцатом веке слово «недоросль» обозначало человека, не имеющего документа об образовании. Такого человека не брали на службу и не разрешали вступать в брак.

Фонвизин больше года прожил во Франции, глубоко вникая в ее просветительские доктрины. Его занимали все сферы социальной жизни страны, он вникал в философию, юриспруденцию. Большое внимание писатель уделял театральным постановкам, в частности, комедиям.

Когда писатель возвратился в Россию, у него возник замысел комедии «Недоросль», где герои получат говорящие фамилии, чтобы глубже выразить смысл комедии. Работа над историей создания заняла у писателя почти три года, началась в 1778 году, а окончательный год написания – 1782.

Тема

Изначально главной темой комедии предполагалась тема воспитания и образования нового поколения, позже в проблематику «Недоросля» были включены социально – политические проблемы, которые касались непосредственно указа Петра Первого о запрещении службы и женитьбы дворян – недорослей.

Семья Простаковых, имеющая недоросля Митрофанушку, имеет глубокие дворянские корни. На первом месте у таких Простаковых стоит гордость за свое знатное сословие, и они не приемлют ничего нового и прогрессивного. Образование им совершенно не нужно, так как крепостное право еще не отменили, и есть кому на них работать. Превыше всего для Простаковых материальное благополучие, алчность и жадность закрывает глаза на образование сына, власть и богатство – важнее.

Семья – это тот пример, на котором растет и воспитывается личность. Митрофанушка полностью отражает поведение и образ жизни своей деспотической матери, но госпожа Простакова не понимает, что именно она является примером для своего сына, и недоумевает, почему он не выказывает ей должного почтения.

Раскрывая проблемы комедии , внутрисемейный конфликт Простаковых, приходим к выводу, что все зависит от воспитания человека. Только от достойного воспитания в семье зависит отношение человека к окружающим посторонним людям, его порядочность и честность. То, чему учит комедия писателя, это образование, уважение по отношению к ближнему, воспитанность и благоразумие.

Композиция

Мастерски выполненные особенности композиции позволяет ознакомиться с главными героями в самом начале пьесы. Уже в конце первого действия происходит завязка сюжета. Тут же в комедии появляются Правдин и Софья. В комедии есть интрига – богатое приданное Софьи, о котором узнают из рассказа Стародума, и разгорается борьба за ее руку.

В следующих двух действиях события стремительно развивается, растет напряженность, пик которой приходится на четвёртое действие, в котором в голову Простаковой приходит мысль похитить Софью и силой выдать замуж за недоросля.

Постепенно развитие действия начинает идти на спад, и в пятом действии комедия приходит к развязке. Становится известно о неудачном похищении Софьи. Правдин обвиняет Простаковых в злых намерениях и угрожает наказанием.

Приходит бумага об аресте имущества Простаковых, Софья и Милон собираются уезжать, а Митрофанушка вынужден идти в солдаты.

Используя в своей комедии такие художественные средства как говорящие фамилии и имена, автор дает нравственную оценку персонажам, которая не вызывает никаких сомнений в ее справедливости. Такова общая характеристика комедии.

Главные герои

Жанр

Пьеса Фонвизина построена по законам классицизма. События происходят в течение суток на одном месте. Комедийная направленность пьесы ярко выражена острой сатирой, беспощадно высмеивающей пороки общества. В пьесе присутствуют и смешные мотивы, пронизанные юмором, есть и печальные, в которых помещица высокомерно издевается над своими крепостными крестьянами.

Писатель был ярым сторонником просвещения, он понимал, что только всестороннее образование и правильное воспитание могут помочь человеку, вырасти в высоконравственную личность, стать достойным гражданином своей родины. Огромную роль в этом должен играть институт семьи, где и закладываются основы человеческого поведения.

Критика восторженно отнеслась к комедии «Недоросль», назвав ее вершиной драматургии России 18 века. Все критики писали о том, что Фонвизин с максимальной точностью и прямолинейностью описал типичные образы и характеристики общества, которые выглядят карикатурно и гротескно, а на самом деле, просто взяты из жизни, и описаны с натуры. И в современном мире комедия остается актуальной: сейчас в обществе также присутствует большое количество «митрофанушек», для которых смысл жизни заключается в материальном богатстве, а образованию отводится минимальное место.

Тест по произведению

Рейтинг анализа

Средняя оценка: 4.2 . Всего получено оценок: 2099.

В комедии «Недоросль», написанной в 1782 году, Д.И.Фонвизин выводит на сцену представителей дворян­ства, развращенного помещичьей властью, и показывает, каким испорченным вырастает молодое поколение в этой среде.

Тема воспитания всегда занимала Фонвизина. Он ра­товал за расцвет просвещения в России и считал, что воспитанные в строгих гражданских правилах дворяне будут достойными руководителями и опекунами крестьян­ского населения страны. А воспитанием молодых дворян никто серьезно не занимался. Чему мог выучиться Митрофан у кучера-немца Вральмана, для того чтобы стать офи­цером или чиновником? Самые дурные качества характера, самые отсталые взгляды на науку характеризуют таких молодых дворян, как Митрофан.

Часто высказывалось мнение, что Стародум, Милон, Софья, Правдин — это идеальные герои, что русская действительность не имела таких людей и что автор выду­мал их. Но среди знакомых Фонвизина были деятели, похожие на Стародума и Правдина, встречались образован­ные и чуткие девушки, напоминающие Софью. Писатель обобщил их черты, представил в одном образе то, что находил у нескольких реальных прототипов.

С еще большей уверенностью изображал он Простако-вых и Скотининых: такие персонажи встречались гораздо чаще среди русского провинциального дворянства второй половины XVIII века.

Для современников Фонвизина речи Стародума звуча­ли политически остро и мудро. Автор устами этого героя излагал патриотические убеждения лучшей части общества. Недаром, начиная свой журнал «Друг честных людей», Фонвизин писал, якобы обращаясь к Стародуму: «Я должен признаться, что за успех комедии моей «Недоросль» дол­жен я вашей особе. Из разговоров ваших с Правдиным, Милоном и Софьей составил я целые явления».

Фигура Простаковой изображена Фонвизиным с не­обычайной верностью и реалистичностью. Он понял нера­зумность ее слепой, животной любви к своему детищу, Митрофану, — любви, которая, в сущности, губит ее сына. Отвратительна Простакова в сценах с крепостными крес­тьянами, жалка при встречах с Правдиным и Стародумом. Фонвизин ясно показывает, что Простаковы не должны управлять людьми. Но при всем этом Простакова — чело­век, пусть безнадежно испорченный средой и воспитанием, но все же человек. Писатель сумел это показать в последней сцене «Недоросля», когда потерявшая власть Простакова, увидев крушение своих замыслов, бросается к сыну: «Один ты остался у меня, мой сердечный друг, Митрофанушка!» А в ответ слышит бессердечное: «Да отвяжись ты, матушка, как навязалась…»

«Вот злонравия достойные плоды!» — говорит Старо­дум, заканчивая комедию. Но его оценка относится не только к Простаковой, но и ко всей системе государствен­ного порядка России.

К числу выдающихся достоинств комедии относится ее язык. Фонвизин дает языковые характеристики героев. Мал и беден словарь Митрофана и Скотинина, свободно владеют речью Стародум, Софья и Правдин. Много грубых и простонародных слов в речах Простаковой, язык ее не отличается от языка крепостных людей. Отставной солдат Цыфиркин пользуется выражениями, употребляющимися в военном быту; семинарист Кутейкин украшает свою речь церковнославянскими словами и цитатами из духовных книг. Чтобы усилить характеристику Вральмана, писатель передает его ломаную русскую речь и подчеркивает непра­вильность произношения.

«Фонвизин казнил в своих комедиях дикое невежество старого поколения и грубый лоск поверхностного и внеш­него европейского полуобразования новых поколений», — писал В.Г.Белинский.

Разделы: Литература

Цели урока:

• Обучающая — знакомство с жанром комедии; выявление конфликта, на котором строится действие в пьесе, его причин, связи с эпохой; рассмотрение комедии с позиций канонов классицизма и отступления от них.
• Развивающая — создание условий для формирования умений и навыков аналитического характера; в монологической форме выражать свою точку зрения, решать проблемную ситуацию
• Воспитательная — воспитание стремления быть по-настоящему нравственным, воспитанным, образованным человеком, умеющим видеть и ценить личность в другом человеке; формирование потребности жить по закону.

Тип урока: Урок формирования новых знаний.

Основной метод: аналитическая беседа с элементами проблемного поиска (анализ текста). Формы: коллективная и индивидуальная. Технологии: сотрудничества “педагог- учитель”.

Оборудование: Портрет Д. И. Фонвизина, тексты комедии “Недоросль”, рабочие тетради по литературе, “Словарь литературоведческих терминов” (редакторы –составители Л.И. Тимофеев и С.В. Тураев)

Оформление доски: портрет писателя, тема урока, проблемы, словарь к теме, конфликты комедии.

Ход урока

1. Организационный момент.

2. Объявление темы урока, цели, проблемы.

Предметом нашего сегодняшнего разговора будет комедия Д.И. Фонвизина “Недоросль”,

А целью — разрешение проблемы “Каким должен быть истинный дворянин и соответствует ли русское дворянство своему назначению”.

3. Эвристическая беседа перед обращением к анализу текста, сообщение заранее подготовленного ученика, учителя.

Давайте вспомним, каким жанром классицисты считали комедию?

Низкие герои, живая жизнь (“низкая”), будничные, низкие страсти.

В 18 веке комедия была очень популярна. Из 334 театральных пьес, шедших на русской сцене во 2-1 половине 18 века, было 188 комедий, 52 трагедии, 39 драм, 32 комические оперы. Комедий было больше половины.

Комедия была теснее связана с жизнью, могла реальнее отразить общественно- политические проблемы. Живая жизнь все больше проникала в произведения.

Чем характеризуется жизнь русского общества 18 века?

Сообщение подготовленного ученика о бесправном положении крепостных крестьян, о вопиющих злоупотреблениях дворян, о произволе.

Сообщение учащегося:

Фонвизин знал об этих злоупотреблениях и выразил свои политические взгляды в “ Рассуждениях о непременных государственных законах”. Он убежден, что страной должны управлять просвещенные государи, что необходимы законы, которым подчинялись бы и цари, реформы, которые бы ограничили произвол дворян; нужно просвещать и воспитывать дворян. И эти мысли Фонвизина сближали его с просветителями.

В чем были убеждены просветители, во что верили?

Мир можно изменить, исправить при помощи просвещения, образования, воспитания и закона, верили в разум, большую роль отводили слову. Их убеждения легли в основу классицизма- литературного направления.

Каков идеал человека для классицистов?

Добродетельный, законопослушный, просвещенный, образованный, воспитанный гражданин, служащий на благо Родины.

Эти идеалы просветительства легли в основу комедии.

4. Анализ комедии.

Каковы же проблемы комедии Фонвизина?

1.Каким должен быть истинный дворянин — и отвечает ли русское дворянство своему назначению?

2. Необходимость просвещения, образования — отсутствие их..

3. Бесправие крестьян- и произвол помещиков.

Итак, перед нами комедия (жанр).

Докажите это. Каковы задачи комедии?

1. Нравоописательная- описание нравов жизни своего времени.

2. Показ идеала жизни и отклонение от него, и это смешно, но и грустно, поэтому сатира и юмор слиты здесь воедино.

3. Конфликт здесь разрешимый. Все это мы видим в комедии “Недоросль”.

Но это классицистская комедия, а у классицистов каждый жанр подчинятся определенным правилам.

Какие признаки классицизма мы видим в комедии Фонвизина?

1. Соблюдение единства времени и места действия.

2. Деление персонажей на высоких и низких, порочных и добродетельных.

3. Вера в разум, что закон и просвещение могут исправить нравы общества- прямое выражение авторского идеала.

4. Наказывается порок, вознаграждается добродетель (дидактизм).

А от каких канонов классицизма отходит писатель?

1. Герой-схема, носитель одного качества (у Фонвизина — индивидуальные черты, типы). Примеры?

2. Внешний комизм, построенный на фарсовых сценах — комические сцены, вплетающиеся в действие, составляющие его основу, смех имеет силу отрицания. Примеры?

3. Чистота жанра- смешение жанров (сатира и юмор). Примеры?

4. Образы положительных героев- черты реально новых людей. Примеры?

5. Условность места действия, выдуманные картины жизни — конкретное место действия, правдивые картины быта. Примеры?

6. Условнее характеры — обусловленность характеров средой, воспитанием. Примеры?

Как же построена пьеса? (Сюжет).

Обычно в комедиях классицистов была фабула, основанная на любовной коллизии, был любовный треугольник, были претенденты (2) на руку молодой девушки, влюбленные в нее. Один из них одерживал победу, другой терпел поражение. Порой их было 3-4.

Т.П. Макогоненко: “Художественное новаторство Фонвизина проявилось в “Недоросле”… в сюжете, раскрывающем главный исторический конфликт…”

Есть в пьесе любовная интрига?

Есть. И внешне действие строится на любовном конфликте.

Когда происходит его завязка? (письмо Стародума, которое читает Правдин).

—Кульминация? (похищение Софьи, организованное Простаковой)

Развязка? (соединение Софьи и Милона).

Разрешение любовного конфликта происходит как бы со стороны, Стародумом: он соединяет Софью и Милона. Побеждает добродетельный герой.

Но у Фонвизина любовный конфликт не главный. История злоключений Софьи составляет лишь фон, на котором разыгрывается главный конфликт пьесы- общественно- политический.

Между кем же происходят серьезные разногласия? Какие?

Между крепостниками и просвещенными дворянами (мир зла – разума, злонравия- добродетели, произвола- закона). Чтобы проследить развитие этого конфликта, нужно снова обратиться к сюжету, который Фонвизин выстраивает мастерски. Он получается многоуровневый, многоструктурный, отсюда несколько сюжетных линий:

1. Учителя, Тришка

Заранее подготовленные учащиеся рассказывают о Вральмане (д.3,явл.3; д.5 явл.6), о Цифиркине (д.2 явл.5; д.5 явл.6), о Кутейкине (д.2 явл.5, д.5 явл.6), о Тришке.

Какова их роль?

Мы узнаем, кто воспитывает, кто и чему учит дворянских детей. Они придают комедии общественное звучание, дают высветить проблему воспитания, образования, просвещения дворян.

Да! Но он изобличает их, презирает, негодует, еще и сатирически показывая их.

2. Связанные с учителями и Тришкой комические сцены, которые имеют первостепенное значение в пьесе (.1 явл.2,3,4; д.2 явл.4,6; д.4 явл.8).

Комические эпизоды объединяют учителей, Тришку и отрицательных героев, создают бытовой фон, на котором раскрываются характеры отрицательных героев, придают конкретность и живость будничной жизни поместного дворянства. Но уже в этих сценах комическое и трагическое переплетаются, высвечиваются проблемы воспитания и образования дворян.

3.Отрицательные герои.

Что мы узнаем от Простаковой и Скотинина об их родственниках?

Как относится Простакова к обучению и воспитанию своего сынка?

Безумно любя своего сынка, она старается оградить его от учения, чтобы Митрофанушка не перетрудился. Стремясь произвести выгодное впечатление на Стародума, она говорит своему дитяти: “ Ты хоть для виду поучись, чтобы дошло до ушей его, как ты трудишься, Митрофанушка…” Математика для нее — “пустота”,”дурацкая наука”; география тоже не нужна- “кучер куда надо и так отвезет…”. Она искренне убеждена, что науки не нужны, так как “и без наук люди живут и жили…”.

Каковы взаимоотношения между членами семьи? (с позиции силы).

Каковы отношения дворян к крепостным? (д.5 явл.4,5; д.1 явл.4), интересы помещиков?

Какое назначение отрицательных героев? Показать, какими и как не должно быть.

А каким изображен двор, придворные? (д.3 явл.1; д.5 явл.1).

И здесь тоже: “Дворянин недостоин быть дворянином!”.

Итак, отрицательные герои — дворяне — одна сторона общественно-политического конфликта (здесь невежество, невоспитанность, отсутствие нравственных понятий, произвол, безграничная власть над крепостными, безнаказанность, бездушие, злонравие).

Когда происходит завязка общественно-политического конфликта?

Кульминация?

Развязка?

Разрешение конфликта происходит извне. Таких, как Простакова, воспитать невозможно, их можно лишь наказать, опираясь на закон, лишить власти — так велико в них искажение нравственных основ.

4. Положительные герои.

Итак, кто пресекает зло в комедии?

Что мы узнаем о Правдине, Стародуме и Милоне, о их убеждениях и взглядах?

Развернутый ответ заранее подготовленного учащегося.

Итак, это люди просвещенные, образованные, благородные, добродетельные, действующие по закону, по велению сердца и разума.

В.Г. Белинский: “В этих честных людях был высказан идеал, к которому должно было стремиться общество…”

Кто же способен исправить дворян, развращенных крепостным правом, разрешить назревший общественно-политический конфликт?

Что говорят об этом Стародум, Правдин?

Оба верят в просвещенного монарха, но Правдин еще не понял истинную суть екатерининского царствования, которому Стародум ставит безнадежный диагноз “больного неизлечимо”.

Хоть восемнадцатый век и не вошёл в историю, как «золотой век» русской литературы, мало кто будет отрицать его значимость для литературного искусства России. Восемнадцатый век стал тем основанием, на котором зародилась новая литература, точкой опоры, от которой отталкивались Пушкин, Грибоедов, Жуковский и прочие великие писатели. Самым знаменитым драматургом той далёкой эпохи является Денис Иванович Фонвизин. В его самом известном творении – пьесе «Недоросль» мы можем наблюдать идеи и посылы, которые будут актуальны в русской литературе вплоть до наших дней.

Замысел создания «Недоросля» родился у Фонвизина после его длительного пребывания во Франции, чьё театральное искусство на тот момент находилось на недостижимой для соседей высоте. Особенно вдохновили писателя комедии, высмеивавшие пороки отдельных представителей французской аристократии и мещанства, а также просветительские идеи Вольтера.

Будучи дворянином, Фонвизин сам мог наблюдать все недостатки правящего класса Российской империи. Сделав комедию на французский лад, драматург намеревался обнажить и высмеять беспокоившие его недостатки помещичьего дворянства. Цель Фонвизина — осудить пороки правящего класса и показать верные нравственные ориентиры — честность, патриотизм, ум и высокий уровень нравственности.

Направление и жанр

«Недоросль», бесспорно, принадлежит к литературному направлению классицизма. Это литературное направление характеризуется особенными идеалами: в нем долг превосходит чувство, а разум — страсти. Так, несмотря на мольбы Простаковой, Правдин отнимает у нее власть над крестьянами: служебный долг он ставит выше сочувствия.

Основные черты и признаки классицизма в пьесе:

• В повествовании сохранено единство места и времени.
• Почти все персонажи носят говорящие фамилии.
• Освещённым порокам придаётся локальный характер, осуждаются лишь отдельные представители помещичьего дворянства, в то время как государство в целом представлено в позитивном ключе.

Жанр «Недоросля» — классическая комедия. Свое место в пьесе заняла сатирическая направленность, однако юмор не слишком резкий. На первом месте у автора стоит не желание обличить и осудить, а с помощью смеха направить людей на путь исправления.

Конфликт

В основе пьесы лежат два конфликта – социально-политический и любовный.

1. Социально-политический конфликт заключается в изобличении крайностей, которые возникают при крепостном праве, в осуждении самодурства и невежества. По ходу сюжета нарастает противоречие между идеалами просвещённой монархии и помещичьей зашоренностью. Однако в финале разум и гуманизм одерживают вверх.
2. Любовный конфликт играет второстепенную роль и лишь дополняет социально-политический. Через него Фонвизин доносит до нас идеи о недопустимости принуждения и всесильности истинной любви.

Особенности конфликта состоят в том, что дворянам противопоставлены сами дворяне, и противостояние происходит в рамках одного сословия. Фонвизин подчеркивает, что российское дворянство неоднородно: в нем есть достойные люди и бесчеловечные тираны.

Суть

Помещица Простакова узнаёт о том, что её воспитанница – Софья, стала наследницей своего богатого дяди. Помещица намеревается насильно выдать девушку замуж за своего сына – Митрофана. Софья всячески противится этому, ведь на уже давно влюблена в молодого офицера Милона. На ее руку претендует и дядя Митрофана, Скотинин.

На помощь героям приходят сначала чиновник-интеллигент Правдин, а потом и дядя Софьи – Стародум. В финале планы Простаковой рушатся: крестьяне переходят под опеку государства, сын грубо отталкивает ее, а Стародум увозит влюблённых молодых людей в Москву.

Главные герои и их характеристика

Система образов отражена в таблице от Многомудрого Литрекона.

имя героя	характеристика
митрофан простаков	невежественный и грубый юноша. законченный эгоист, не ценящий даже родную мать. безынициативен и управляем. его ничего не интересует, кроме комфорта и довольства, но бороться за них он не умеет, поскольку вечная опека матери сделала его несамостоятельным. в конце повествования его устраивают на государственную службу.
госпожа простакова	неграмотная, грубая и жестокая помещица. недалёкая домашняя тиранша, держит в страхе весь дом. безраздельно управляет своим мужем и крепостными. не ценит жизни тех, кто слабее её, и не считается с их мнением. крестьян бьет и оскорбляет без всяких причин. при этом любящая мать, превратившая, однако, своего сына в образец безнравственности.
софья	образованная, честная и добрая девушка. сирота. будучи воспитанницей в доме простаковых, была жертвой самодурства матери семейства. несмотря на это, она выросла умной, покорной и скромной. когда же софья становится единственной наследницей своего богатого дяди, её пытаются силой выдать за муж за митрофана. в конце повествования получает возможность выйти замуж за своего возлюбленного – милона.
правдин	чиновник, назначенный проинспектировать поместье простаковых. став свидетелем несправедливостей со стороны простаковой, прикладывает все усилия для того, чтобы избавить софью и крепостных людей от тирании. в итоге он отбирает крепостных простаковых в пользу государства и отправляет митрофана на службу, несмотря на мольбы и попытки подкупа. это честный и нравственный человек, который во всем согласен со стародумом.
стародум	старый дворянин. дядя софьи. долгое время провёл в сибири, откуда от него не было никаких вестей. честно заработал огромное состояние и сделал софью своей единственной наследницей. мудр и справедлив. спас племянницу от брака с митрофаном и позволил ей самой выбрать себе мужа. он является носителем старых дворянских ценностей петровского времени и пропагандирует скромность, благородство и честную службу во благо отечества без блата.
тарас скотинин	брат госпожи простаковой. необразованный помещик-самодур. ни во что не ставит человеческую жизнь, но всем сердцем любит свиней. также добивался руки софьи, но потерпел неудачу. это алчный, грубый, жадный, но трусливый герой, каждое действие которого комично.

Темы

Тематика пьесы «Недоросль» выдержана в духе классицизма:

• Воспитание – основная тема комедии. Фонвизин показал нам, как не стоит воспитывать детей. Драматург, не отрицая родительской любви к своему чаду, показывает нам, что происходит, когда любовь к ребёнку доходит до крайности.
• Образование – Получение знаний ставится писателем на первое место. По его мнению, только образованный человек может быть по-настоящему благородным, тогда, как прозябающие во тьме невежества – недалёкие и подлые люди.
• Нравственность — Стародум говорит, что только нравственному человеку знания идут на пользу. Он считает, что благонравие — это основа образования и воспитания. Он ставит необходимость доброты, справедливости и честности на первое место. Это и есть идеалы Фонвизина.
• Любовь . Автор указывает на основу брака — любовь. В его времена было популярно жениться и выходить замуж по расчету, но в этом укладе жизни очевидна безнравственность. На примере Софьи и Милона он показывает, как должны формироваться семьи: только по взаимной склонности и благословению родных.

В данном произведении еще много тем, и Многомудрый Литрекон охотно перечислит их, если есть необходимость. Пишите в комментариях об этом, и он дополнит разбор.

Проблемы

Проблематика пьесы «Недоросль» богата незаурядными вопросами, актуальными до сих пор.

1. Злонравие – В своей пьесе Фонвизин решительно осуждает самодурство, зависть, жадность и грубость, свидетелем которых он был. По его мнению, дворянство должно отринуть все свои недостатки, чтобы превратить Россию в настоящую европейскую страну.
2. Невежество – Глупость в глазах драматурга выглядит самым страшным человеческим пороком. В его пьесе все невежды – омерзительные ничтожества, тогда как все положительные персонажи умны и образованы.
3. Воспитание истинного гражданина – В своей комедии Фонвизин изобразил идеальных, по его мнению, граждан Российской империи в лице Правдина и Стародума. Образованные и добродетельные люди, которые думают прежде всего о благе государства, но при этом сохранили в себе благородство, человечность и искренность.
4. Также автор высмеял такие пороки, как грубость, жестокость, эгоизм, алчность, жадность, лицемерие, ложь и лесть. По его мнению, их искоренить может только сама система: если преуспевать будут только честные и высоконравственные люди, то все остальные станут такими же, потому что увидят в этом выгоду для себя.

Перечислять основные проблемы из комедии «Недоросль» можно долго, но если Вам нужен полный список, пишите Литрекону в комментариях, и он дополнит статью.

Основная идея

Комедия демонстрирует нам реакционных представителей помещичьего дворянства, окутанных предрассудками и пороками. Оно представляется поистине омерзительным, но в то же время жалким и доживающим свой век. На смену Простаковым и Скотининым приходят Правдины, Стародумы и Софьи, и в конечном итоге высоконравственные качества всегда побеждают невежество и подлость. Это и есть главная мысль комедии «Недоросль».

Разумеется, автор вложил в пьесу «Недоросль» общественный смысл, типичный для эпохи просвещения. Нравственность должна исходить от государя — идеального абсолютного монарха, который обязан давать места, титулы и богатства только достойным людям.

Правдин. Несчастиям людским, конечно, причиною собственное их развращение; но способы сделать людей добрыми…

Стародум. Они в руках государя. Как скоро все видят, что без благонравия никто не может выйти в люди; что ни подлой выслугой и ни за какие деньги нельзя купить того, чем награждается заслуга; что люди выбираются для мест, а не места похищаются людьми, — тогда всякий находит свою выгоду быть благонравным и всякий хорош становится.

Чему учит

С другой стороны, пьеса говорит нам о том, как важно, несмотря на внешнее давление, сохранять в себе благородство, ум, волю и стремление к самосовершенствованию, ведь именно эти качества и делают человека человеком. Такова мораль комедии «Недоросль».

Критика

Вопреки ожиданиям Фонвизина, его пьеса была очень неоднозначно встречена современниками. Многие дворяне увидели в «Недоросле» не попытку указать на недостатки общества, а прямой навет и клевету.

Однако позже драматург был оценён в полной мере. Сам Пушкин считал творчество Фонвизина искренним и весёлым, и очень сожалел о том, что таких писателей в русской литературе совсем немного.

«Недоросль» … единственный памятник народной сатиры, «Недоросль», которым некогда восхищалась Екатерина и весь ее блестящий двор…» (А. С. Пушкин, статья «Опровержение на критики»)

Значение пьесы «Недоросль» для русской литературы трудно переоценить. Его всячески подчеркивали такие авторитетные писатели, как Н.В. Гоголь.

Комедия Фонвизина поражает огрубелое зверство человека, происшедшее от долгого бесчувственного, непотрясаемого застоя в отдаленных углах и захолустьях России… Все в этой комедии кажется чудовищной карикатурой на русское. А между тем нет ничего в ней карикатурного: все взято живьем с природы и проверено знаньем души… » (Н. В. Гоголь, «Выбранные места из переписки с друзьями»)

Мнение критиков о «Недоросле» было бы неполным без рецензии В.Г. Белинского.

«…«Недоросль» и «Бригадир», уже согнанные с театра, никогда не будут изгнаны ни из истории русской литературы, ни из библиотек порядочных людей. Не будучи комедиями в художественном значении, они — прекрасные произведения беллетрической литературы, драгоценные летописи общественности того времени. …и честь и слава уму и таланту Фонвизина, что он угадал, что можно и что нужно было в его время…» (В. Г. Белинский, «Русская литература в 1841 году»)

Но далеко не все рецензенты хвалебно воспевали произведение. Были и негативные отклики, связанные с искусственностью образов героев:

…комедия «Недоросль», хотя и явилась выражением общественного самосознания, лишена горячего, живого чувства протеста… Как и сам Фонвизин, его «идеалы» — Правдин, Стародум, Милон, Софья — все «умны», порядочны, но холодны, чересчур благоразумны и заученным манером излагают господствующую теорию «просвещенного деспотизма»…» (С. М. Брилиант, «Денис Фонвизин. Его жизнь и литературная деятельность», 1892 г.)

Советская критика положительно оценивала вклад автора в литературу и развитие общественной мысли.

Фонвизин в силу своей классовой принадлежности не пошел против крепостного права, хотя и дал богатейший материал, свидетельствующий о крестьянском бесправии. Тем не менее художественные достоинства его комедий несомненны. Он индивидуализирует образы учителей (Кутейкина, Цыфиркина, Вральмана), он доводит до высокого совершенства диалог, он воссоздает современный ему поместный быт во всей его колоритной уродливости. Образы Простаковой и Митрофанушки сделались традиционными, вошли в плоть и кровь последующей литературы…» (Статья «Драма» // «Литературная энциклопедия в 11 томах», 1929-1939 гг, том 3)

Уже в наши дни «Недоросль» считается образцом классической литературы, который лежит в основе всей русской литературы. Едва ли можно найти человека, который не читал бы этой пьесы или не знал о ней, а имя Митрофана для некоторых людей стало нарицательным.

Рассмотрим особенности комедии, которую создал Фонвизин («Недоросль»). Анализ этого произведения — тема данной статьи. Пьеса эта является шедевром отечественной литературы 18 столетия. Это произведение входит сегодня в фонд русской классической литературы. Оно затрагивает целый ряд «вечных проблем». А красота высокого слога и сегодня привлекает множество читателей. Название этой пьесы связано с изданным Петром I указом, согласно которому «недорослям» (молодым дворянам) запрещается без образования поступать на службу и жениться.

История создания пьесы

Еще в 1778 году возник замысел этой комедии у ее автора, которым является Фонвизин. «Недоросль», анализ которой нас интересует, была написана в 1782 году и в этом же году представлена публике. Следует кратко осветить время создания интересующей нас пьесы.

Во время правления Екатерины II написал Фонвизин «Недоросль». Анализ героев, представленный ниже, доказывает, что они являлись героями своего времени. Период в развитии нашей страны связан с господством идей Они были заимствованы русскими у французских просветителей. Распространению этих идей, их большой популярности в среде образованного мещанства и дворянства способствовала во многом сама императрица. Она, как известно, переписывалась с Дидро, Вольтером, д’Аламбером. Кроме того, Екатерина II открывала библиотеки и школы, поддерживала различными средствами развитие искусства и культуры в России.

Продолжая описывать комедию, которую создал Д. И. Фонвизин («Недоросль»), анализируя ее особенности, следует отметить, что, как представитель своей эпохи, автор, безусловно, разделял идеи, господствовавшие в то время в дворянском обществе. Он постарался отразить их в своем произведении, перед читателями и зрителями обнажив не только положительные моменты, но и указав на заблуждения и недочеты.

«Недоросль» — образец классицизма

Анализ комедии «Недоросль» Фонвизина требует рассматривать эту пьесу как часть культурной эпохи и литературной традиции. Это произведение считается одним из лучших образцов классицизма. В пьесе наблюдается единство действия (в ней не найти второстепенных сюжетных линий, описывается лишь борьба за руку Софьи и ее имущество), места (персонажи на большие расстояния не перемещаются, все события происходят либо около дома Простаковых, либо внутри него), и времени (не более суток занимают все события). Кроме того, использовал «говорящие» фамилии, которые являются традиционными для пьесы классицистической, Фонвизин («Недоросль»). Анализ показывает, что, следуя традиции, он разделил своих персонажей на положительных и отрицательных. Положительные — это Правдин, Стародум, Милон, Софья. Их противопоставляет Простакову, Митрофану, Скотинину Д. И. Фонвизин (пьеса «Недоросль»). Анализ их имен показывает, что они дают читателю понять, какие черты в образе того или иного персонажа являются превалирующими. Например, олицетворением морали и правды в произведении является Правдин.

Новый жанр комедии, его особенности

«Недоросль» на момент создания стала важным шагом вперед в развитии литературы нашей страны, в частности, драматургии. Денис Иванович Фонвизин создал новый социально-политической. В ней гармонично совмещается ряд изображенных с сарказмом, иронией, смехом реалистичных сцен из жизни некоторых заурядных представителей высшего общества (дворянства) с проповедями о морали, добродетели, необходимости воспитания человеческих качеств, которые были свойственны просветителям. Поучительные монологи при этом восприятия пьесы не отягощают. Они дополняют это произведение, в результате чего оно становится более глубоким.

Первое действие

На 5 действий поделена пьеса, автор которой — Фонвизин («Недоросль»). Анализ произведения предполагает описание организации текста. В первом действии мы знакомимся с Простаковыми, Правдиным, Софьей, Митрофаном, Скотининым. Характеры персонажей вырисовываются сразу, и читатель понимает, что Скотинин и Простаковы — а Софья и Правдин — положительные. В первом действии происходит экспозиция и завязка этого произведения. В экспозиции мы знакомимся с героями, узнаем, что на попечении у Простаковых живет Софья, которую собираются выдать за Скотинина. Чтение письма от Стародума — это завязка пьесы. Софья теперь оказывается богатой наследницей. Со дня на день возвращается ее дядя для того, чтобы забрать девушку к себе.

Развитие событий в пьесе, которую создал Фонвизин («Недоросль»)

Анализ произведения продолжим описанием того, как развивались события. 2-е, 3-е и 4-е действия — это их развитие. Мы знакомимся со Стародумом и Милоном. Простакова и Скотинин пытаются понравиться Стародуму, но их лесть, фальшивость, необразованность и огромная жажда наживы лишь отталкивает. Они выглядят глупо и смешно. Наиболее смешной сценой этого произведения является опрос Митрофана, во время которого обнажается глупость не только этого юноши, но также и его матери.

Кульминация и развязка

5-е действие — кульминация и развязка. Следует заметить, что мнения исследователей о том, какой момент следует считать кульминацией, разнятся. Существует 3 самых популярных версии. Согласно первой, это похищение Простаковой Софьи, согласно второй — чтение Правдиным письма, в котором говорится о том, что под его опеку переходит имение Простаковой, и, наконец, третья версия — ярость Простаковой после того, как она понимает собственное бессилие и пытается «отыграться» на своих слугах. Справедлива каждая из этих версий, поскольку рассматривает с разных точек зрения интересующее нас произведение. Первая, например, выделяет сюжетную линию, посвященную женитьбе Софьи. Анализ эпизода комедии Фонвизина «Недоросль», связанного с женитьбой, действительно, позволяет считать его ключевым в произведении. Вторая версия рассматривает пьесу с социально-политической точки зрения, выделяя момент, когда в поместье торжествует справедливость. Третья внимание акцентирует на исторической, согласно которой Простакова является олицетворением ушедших в прошлое обессиливших принципов и идеалов старого дворянства, которые, однако, еще не верят в собственное поражение. Это дворянство, по мнению автора, основано на непросвещенности, необразованности, а также низких моральных устоях. Во время развязки все покидают Простакову. У нее не осталось ничего. Указывая на нее, Стародум говорит, что это «достойные плоды» «злонравия».

Отрицательные персонажи

Как мы уже отмечали, главные персонажи четко делятся на отрицательных и положительных. Митрофан, Скотинин и Простаковы — отрицательные герои. Простакова — женщина, ищущая наживы, необразованная, грубая, властная. Она для получения выгоды умеет льстить. Однако Простакова любит своего сына. «Тенью» жены предстает Простаков. Это безвольный персонаж. Его слово мало значит. Скотинин является братом госпожи Простаковой. Это столь же необразованный и глупый человек, довольно жестокий, подобно его сестре падкий на деньги. Для него прогулка к свиньям на скотный двор — лучшее занятие. Митрофан — типичный сын своей матери. Это избалованный юноша 16-ти лет, унаследовавший от дяди любовь к свиньям.

Вопросы и наследственности

В пьесе, следует отметить, важное место отводит вопросу родственных связей и наследственности Фонвизин («Недоросль»). Анализируя этот вопрос, скажем, например, что Простакова лишь замужем за своим супругом («простым» человеком, который не желает многого). Однако она на самом деле Скотинина, сродни своему брату. Сын же ее вобрал качества обоих своих родителей — «животные» качества и глупость от матери и безвольность от отца.

Похожие родственные связи можно проследить и между Софьей и Стародумом. Оба они честны, добродетельны, образованы. Девушка слушает дядю внимательно, уважает его, «впитывает» науку. Пары противоположностей создают отрицательные и положительные герои. Дети — избалованный глупый Митрофан и кроткая умная Софья. Родители любят детей, однако к их воспитанию подходят по-разному — Стародуб беседует на темы правды, чести, морали, а Простакова лишь балует Митрофана и говорит о том, что ему не пригодится образование. Пара женихов — Милон, видящий идеал и своего друга в Софье, любящий ее, и Скотинин, подсчитывающий состояние, которое он получит после женитьбы на этой девушке. Софья при этом как человек ему не интересна. Скотинин даже не пытается обустроить своей невесте удобное жилье. Простаков и Правдин являются в действительности «голосом правды», своеобразными «ревизорами». Но в лице чиновника мы находим активную силу, помощь и реальное действие, а Простаков — персонаж пассивный. Единственное, что смог сказать этот герой — упрекнуть в конце пьесы Митрофана.

Проблемы, которые поднимает автор

Анализируя становится ясно, что в каждой из вышеописанных пар персонажей отражается отдельная проблема, которая раскрывается в произведении. Это проблема образования (которая дополняется примером учителей-недоучек типа Кутейкина, а также самозванцев, таких как Вральман), воспитания, отцов и детей, семейной жизни, взаимоотношений между супругами, отношения дворян к слугам. Через призму просветительских идей рассматривается каждая из этих проблем. Фонвизин, свое внимание обостряя на недостатках эпохи путем использования комических приемов, ударение делает на необходимости изменить устаревшие, традиционные, ставшие неактуальными устои. Они затягивают в болото глупости, злонравия, уподобляют людей животным.

Как показал проведенный нами анализ пьесы Фонвизина «Недоросль», главная идея и тема произведения — необходимость воспитания дворянства в соответствии с просветительскими идеалами, основы которых и сегодня актуальны.

Образ и характеристика Митрофанушки в комедии Недоросль с цитатами

Описание Митрофана из комедии «Недоросль»

Фамилия «недоросля» Митрофана – Простаков, дворянин по происхождению.

Внешность юноши неуклюжа и неприятна.

Простаков-младший любит много покушать, поэтому он полный с пухлыми щеками:

• «а я почти и вовсе не ужинал <�…> солонины ломтика три, да подовых, не помню, пять»;
• «квасу целый кувшинец выкушать изволил».

Кафтан его трещит по швам от постоянного поедания булок.

Автор чётко дает понять сколько лет юноше. Это 16-летний молодой человек, имеющий ум маленького мальчика.

Он не имеет интересов и увлечений, ничем выдающимся не отличается.

Митрофан – бездельник и лентяй. Мальчик с детства привык получать все, что захочет, не прикладывая никаких усилий.

Воспитание Митрофанушки

Характеристику главного героя хорошо дополняет воспитание, которое дали ему родители. Отец и мать души не чают в сыне, любовь матери к сыну носит больной и уничтожающий личность мальчика характер.

Фонвизин специально использует «говорящие» имена и фамилии, чтобы подчеркнуть качества персонажей. Имя Митрофана означает «похожий на мать».

Характером сын действительно пошел в мать. Юноша – подлый, любит ябедничать и жаловаться

:
«я опять нажалуюсь матушке».
Мнение отца Митрофана не интересует, он запугивает отца матерью. Жестокий и бессердечный мальчик, когда во сне видит, что матушка бьет отца, жалеет мать, а не отца.

Митрофан – настоящий маменькин сыночек.

Мать вырастила сына беспомощным к взрослой жизни, мелочным, заурядным. Юноша не умеет любить, готов только притворяться, что любит, ради корыстных целей.

Родители избаловали сына: «пока Митрофанушка еще в недорослях, пока его и понежить».

Вывод

В комедии «Недоросль» автор поднимает глобальные социальные проблемы, которые были актуальны для общественной жизни России в XVIII веке. Он демонстрирует срез дворян и помещиков, которые были разделены на два лагеря: умные, образованные и воспитанные аристократы с высокими моральными принципами в противовес невежественным, тёмным и жестоким помещикам-самодурам, тянувшим Россию на самое дно.

К последним автор относит и Тараса Скотинина, чья говорящая фамилия недвусмысленно указывает на его черты характера и отношение к людям. Роль героя заключается в том, чтобы продемонстрировать острую необходимость перемен в российском обществе. Характеристика Скотинина с цитатами позволит лучше подготовиться к уроку литературы, написать сочинение на заданную тему.

Собранный материал, включающий в себя цитаты из текста, позволяет самостоятельно дать характеристику герою по плану, поможет составить развёрнутую письменную работу или написать сочинение на заданную тему.

Образование

Простаков-младший очень глуп, ему трудно дается получение образования. Четыре года обучения не дали никаких результатов.

Мать мальчика тоже необразованная, искренне недоумевает, зачем мальчику получать образование.

Учитель грамоты так отзывается об умственных способностях юноши: «Четвертый год мучу свой живот. По сесть час, кроме задов, новой строки не разберет; да и зады мямлит, прости Господи, без складу по складам, без толку по толкам».

Какие качества объединяют Скотинина, Простакова и Митрофана

Простакова, Скотинина и Митрофана делает похожими тот факт, что все они являются отрицательными героями комедии «Недоросль». Всех троих объединяет то, что они не принимают просвещения, глупы, думают лишь о своей выгоде.

Скотинин – брат Простаковой

, как и его сестра — не образован. Его умственные способности не развиты совсем. Расчетливый и корыстный, думает лишь о материальной выгоде. Таким же растет Митрофан. Подобен своему дяде: мечтает вкусно поесть и поскорее жениться.

Мальчик до такой степени не способен к учебе, что один из учителей не берет плату, потому что не смог ничему научить недоросля.

Простаков – отец Митрофана

, слабо-мыслящий и глупый человек: «помещика дурака бессчетного», «ваше крайнее слабомыслие». Не имеет своего мнения и просто «плывет по течению».

Более того, все три персонажа абсолютно заурядные, не имеют увлечений и интересов. Они не живут, а существуют. Страшнее то, что они этого не способны понять.

ЦИТАТЫ ПО ПЕРСОНАЖАМ

Правдин

Прямое достоинство в человеке есть душа.

Я родился в Москве, ежели вам то знать надобно, а деревни мои в здешнем наместничестве.

Извините меня, сударыня. Я никогда не читаю писем без позволения тех, кому они написаны.

Притом, из собственного подвига сердца моего, не оставляю замечать тех злонравных невежд, которые, имея над людьми своими полную власть, употребляют ее во зло бесчеловечно.

Ласкаюсь, однако, положить скоро границы злобе жены и глупости мужа. Я уведомил уже о всех здешних варварствах нашего начальника и не сумневаюсь, что унять их возьмутся меры.

Мне поручено взять под опеку дом и деревни при первом бешенстве, от которого могли бы пострадать подвластные ей люди.

Я прошу извинить меня, что вас оставлю.

Когда же у вас могут быть счастливы одни только скоты, то жене вашей от них и от вас будет худой покой.

Стародум

Невежда без души – зверь.

Для прихотей одного человека всей Сибири мало.

Прямое достоинство в человеке есть душа. Без нее просвещеннейшая умница – жалкая тварь.

Честный человек должен быть совершенно честный человек

.

Не тот богат, который отсчитывает деньги, чтоб прятать их в сундук, а тот, который отсчитывает у себя лишние, чтоб помочь тому, у кого нет нужного.

Каждый должен искать своего счастья и выгод в том одном, что законно.

Имей сердце, имей душу, и будешь человек во всякое время.

Я отошел от двора без деревень, без ленты, без чинов, да мое принес домой неповрежденно, мою душу, мою честь, мои правила.

Гораздо честнее быть без вины обойдену, нежели без заслуг пожаловану.

Милон

Вижу и почитаю добродетель, украшенную рассудком просвещенным.

Я влюблен и имею счастие быть любим.

Судья, который, ни убояся ни мщения, ни угроз сильного, отдал справедливость беспомощному, в моих глазах герой.

В мои леты и в моем положении было бы непростительное высокомерие считать все то заслуженным, чем молодого человека ободряют достойные люди.

Софья

Дядюшка! Истинное мое счастье то, что ты у меня есть. Я знаю цену.

Все мое старание употреблю заслужить доброе мнение людей достойных.

Сколько горестей терпела я со дня нашей разлуки! Бессовестные мои свойственники.

Читала теперь книжку… французскую. Фенелона, о воспитании девиц.

Митрофанушка

Не хочу учиться, хочу жениться!

Да всяка дрянь в голову лезла, то ты батюшка, то ты матушка.

Белены объелся.

Поучусь; только чтоб это было в последний раз и чтоб сегодня же быть сговору!

Ну, еще слово молви, старая хрычовка! Уж я те отделаю.

Да отвяжись матушка, как навязалась!

По мне, куда велят!

Простакова

Одна моя забота, одна моя отрада – Митрофанушка.

Век живи, век учись, друг мой сердешный!

Без наук люди живут и жили.

А я люблю, чтоб и чужие меня слушали.

С утра до вечера, как за язык повешена, рук не покладаю: то бранюсь, то дерусь; тем и дом держится.

Я холопам потакать не намерена. Поди, сударь, и теперь же накажи.

Скотинин

Ученье – вздор.

Я отроду ничего не читывал, сестрица! Бог меня избавил этой скуки.

Не будь тот Скотинин, кто чему-нибудь научиться захочет.

У меня такой обычай, как что забору в голову, то из нее гвоздем не выколотишь.

Учителя Митрофана

Героя обучают три учителя: Цыфиркин, Кутейкин, Вральман.

Цыфиркин обучает арифметике. После двух лет занятий его ученик едва может сосчитать до трех: «дал мне Бог ученичка. Бьюсь с ним третий год: трех перечесть не умеет». Сам по себе человек хороший, трудолюбивый и бескорыстный: «праздно жить не люблю».

Кутейкин преподает русский и церковнославянские языки. Хитрый и корыстный человек. Его личное образование оставляет желать лучшего, окончил всего лишь первые классы духовной семинарии.

Вральман, немец по происхождению, преподает французский язык. Пойти в учителя решил из-за материальных трудностей, до этого работал кучером. Конечно же французского Вральман не знает, он настоящий проходимец и врун.

Такие малограмотные учителя не способны дать никакого образования юноше, они сами нуждаются в нем.

Кутейкин

Кутейкин учит Митрофанушку грамоте. Он – местный дьячок. Сам он бросил учебу в семинарии, испугавшись сложностей и настоящих «заумных» наук. Это говорит о том, что сам Кутейкин безграмотен. Чему же он может научить Митрофанушку, тем более когда ученик сам не стремится к знаниям и только и делает, что ленится и отдыхает. Сам по себе Кутейкин не является образцом учителя. Он малограмотен, невежественен и труслив. Зато когда дело доходит до рассчета, он требует оплаты за работу, которая оказалась бессмысленной и неэффективной, и за «стоптанные сапоги». За расчетом его отправляют к самой Простаковой. Но он боится ее и сам отказывается от оплаты из нежелания иметь дел с хозяйкой.

Кто страшнее — Простакова или Митрофан

Портреты помещицы Простаковой и ее сыночка очень похожи. Митрофан – мужская копия своей матери.

Своей любовью Простакова душит мальчика и убивает в нем все человеческое, ее любовь не здоровая. Матушка защищает юношу от всех и всего. Обычная забота о том, как накормить сына, заканчивается тем, что мальчик не может ходить из-за колик в животе.

Мать жестока по отношению к мужу и слугам, сын жесток по отношению ко всем, в том числе к матери. Так же, как и родительница, не образован, но оба считают себя умнее всех остальных, в них нет и частички эмпатии. Они эгоистичные и самовлюбленные, свои потребности и желания они ставят превыше остальных.

Простакова страшна, ведь воспитала такого ужасного человека, который вдвойне ее страшней.

Биография

Митрофанушка — сын неприятной четы по фамилии Простаковы. Мать героя, провинциальная дворянка по происхождению, — злая женщина. Делает, что пожелает, позволяет себе всевозможные зверства по отношению к крепостным и дворовым слугам. При этом любит сына и пытается устроить того в жизни, женив на Софье, девушке с приличным наследством.

Персонажи комедии «Недоросль»

Сама Софья влюблена в молодого офицера по имени Милон. Это добрая и благонравная девушка, которой дали образование, у нее есть опекун — дядя, владеющий большим состоянием. У Простаковой есть брат по имени Тарас Скотинин (Митрофанушке этот персонаж приходится дядей). Скотинин, любитель свиней, тоже желает жениться на Софье из-за наследства.

Отец Митрофанушки — слабый и безвольный человек, не образован, не может даже прочитать письма. Он находится под каблуком у супруги и думает только о том, как бы угодить той. Авторитарная жена легко может поколотить папашу Простакова.

Митрофанушка и его матушка

Митрофанушка, также, как и родители, не хотел учиться, а стремился устроиться в жизни за счет женитьбы. У героя есть учителя, среди которых один бывший семинарист, который учит героя грамоте по Псалтыри, сержант в отставке, который преподает арифметику, и бывший кучер, немец по происхождению и знатный курильщик, выдающий себя за ученого.

Этот проходимец нанят, чтобы обучать героя французскому языку и неким «наукам», но обязанностей своих не выполняет и лишь мешает работать прочим преподавателям. Мать на самом деле вовсе не озабочена воспитанием и образованием героя, а лишь следует модным тенденциям в обществе того времени. У Митрофанушки также есть кормилица, которую называют «Еремеевна».

Митрофанушка с родителями и учителем

Софья приходится семейству Простаковых дальней родственницей. Девушка выросла в Москве и получила хорошее воспитание, но после смерти матери (отец умер еще раньше) попадает в лапы Простаковых. Те «приглядывают» за принадлежащим Софье имением, одновременно обкрадывая героиню. Идея выдать девушку за Митрофанушку рождается в голове Простаковой после того, как на горизонте появляется богатый дядюшка, которого считали умершим, а вместе с тем и потенциальное наследство.

На почве грядущей женитьбы у Митрофанушки возникает конфликт с дядей, Тарасом Скотининым, который тоже думает жениться на Софье, чтобы прибрать к рукам свиней в принадлежащих девушке деревнях.

Митрофанушка и Скотинин

Софья тем временем встречается с давним своим возлюбленным, молодым офицером Милоном, а богатый дядюшка приезжает, чтобы забрать племянницу от Простаковых. Простакова пытается подольститься к дядюшке Софьи, чтобы тот согласился на женитьбу Митрофанушки на девушке. Дядя, однако, твердо намерен отвезти Софью в Москву следующим же утром.

Дядюшка дает девушке возможность выбрать жениха самой, и та отдает руку Милону, с которым зналась еще в доме матери. Узнав об этом, мать Митрофанушки составляет заговор. Люди Простаковых пытаются выкрасть Софью, чтобы обвенчать девушку с Митрофанушкой насильно. Милон застает эту сцену и предотвращает покушение, после чего имение и деревни Простаковых изымаются у них по правительственному указу. В финале бездельника Митрофанушку отправляют на службу.

Милон и Софья

Подобный образ жизни и отсутствие толкового образования были распространены среди детей провинциального дворянства в те годы, поэтому Митрофанушка в пьесе изображен не как частный случай неудачного воспитания, а как образ эпохи. Внешность героя не описывается в пьесе прямо, но можно предположить, что Митрофанушка выглядел как типичный представитель провинциальной дворянской молодежи того времени.

Герой не склонен к конструктивной деятельности, учебе, работе и любым осмысленным занятиям. Погонять голубей, полоботрясничать, объесться сверх меры, словом, как-то убить время в нехитрых развлечениях — таковы жизненные цели Митрофанушки, и мать всячески поощряет подобное поведение героя.

Семья Простаковых

Характеристика героя выглядит неприятно — Митрофанушка алчен и скуп, груб, склонен к интригам, обману и мошенничеству, как и мать. Простакова любит сына, несмотря на свойственную ей жестокость к прочим людям, Митрофанушка же предал мать, оттолкнул ту, когда мать пыталась найти у героя поддержку.

Митрофанушка по сути — эгоист, думает исключительно о собственном комфорте, не интересуясь родными. Отношение к учебе у героя вполне однозначное — одного из учителей Митрофанушка называет «гарнизонной крысой», любые попытки дать юноше хоть какие-то знания наталкиваются на полное нежелание того учиться.

Смешон ли Митрофан

Младший Простаков смешон и несуразен. Все сцены с ним глупы и комичны. Ведь это ненормально — обжираться всю ночь и с утра жаловаться на голод. Смешно привязывать няньку пятнадцатилетнему парню.

Несмотря на то, что образ главного героя является объектом сатиры, сущность юноши ужасна и страшна:

грубый, озлобленный, глупый и бессердечный. Его отношение к окружающим его людям удивляет.

Любящих его родителей мальчик не уважает вовсе. Если представить, что такие «митрофанушки» есть в каждой семье, будущее страны оказывается в серьезной опасности.

Краткая характеристика

Перед прочтением данного анализа рекомендуем ознакомиться с самим произведением Недоросль.
Полное имя — Тарас Скотинин.

Возраст — не указан, мужчина средних лет.

Род занятий — помещик.

Семья — не женат, сестра г-жа Простакова.

Социальное положение — дворянин, помещик.

Происхождение — родом из старинного дворянского семейства.

Воспитание — воспитанием никто не занимался, примером для подражания стал необразованный, глупый и жадный отец.

Образование — необразованный мужчина, не умеющий даже читать.

Внешность — не указана.

Характер — настойчивый, невежественный, трусливый.

Положительные черты — отсутствуют, один из отрицательных персонажей пьесы, способный испытывать нежные чувства лишь к свиньям.

Отрицательные черты — жадный, глупый, невежественный, туголобый.

Произведение — «Недоросль».

Автор — Денис Иванович Фонвизин.

Влияние состава растительного покрова на разнообразие подлеска лесов южного умеренного пояса | Forest Ecosystems

Allué CJ, Arranz A, Bava JO, Beneitez JM, Collado L, García-López JM (2010) Caracterización y cartografía fitoclimáticas del bosque nativo subantártico en la Israagonia del Grandeonia Для Syst 2: 189–207

Google ученый

Аугусто Л., Рейнджер Дж., Бинкли Д., Роте А. (2002) Влияние нескольких распространенных древесных пород европейских лесов умеренного пояса на плодородие почвы.Ann For Sci 59: 233–253

Статья Google ученый

Аугусто Л., Дюпуи Дж. Л., Рейнджер Дж. (2003) Влияние древесных пород на подлесковый растительный покров и условия окружающей среды в лесах умеренного пояса. Ann For Sci 60: 823–831

Статья Google ученый

Barbier S, Gosselin F, Balandier P (2008) Влияние древесных пород на разнообразие подлеска и задействованные механизмы.Критический обзор умеренных и северных лесов. Для Ecol Manage 254: 1–15

Статья Google ученый

Биттерлих В. (1984) Идея реласкопа. Относительные измерения в лесном хозяйстве. CAB Лондрес, Англия

Google ученый

Borchsenius F, Nielsen PK, Lawesson JE (2004) Структура и разнообразие растительности древнего умеренного лиственного леса на юго-западе Дании.Завод Ecol 175: 121–135

Артикул Google ученый

Бранкалеони Л., Стрелин Дж., Гердол Р. (2003) Взаимосвязь между геоморфологией и растительностью в субантарктических андских тундрах Огненной Земли. Полярная биол 26: 404–410

Google ученый

Брюс М.К., Меффорд М.Дж. (1999) PC-ORD: многомерный анализ экологических данных. MJM Software Design, Орегон

Google ученый

Чавес В., Макдональд С.Е. (2012) Разделение разнообразия сосудистого подлеска в смешанных лесах бореальных лесов: важность смешанного полога для сохранения разнообразия.Fore Ecol Manage 271: 19–26

Статья Google ученый

Корреа Миннесота (1969–1998) Флора Патагоника. Colección Científica INTA Tomo 8. Partes II, III, IVb, V, VI y VII. Буэнос айрес.

Cruz G, Ibarra M, Promis A, Cabello G (2007) Tipos de bosques, estructura y dinámica natural. В: Cruz G, Caldentey J (eds) Caracterización, silvicultura y uso de los bosques de coihue de Magallanes ( Nothofagus betuloides (Mirb.) Blume) en la XII Región de Chile. Icaro Editions, Сантьяго, Чили

Дейл В.Х., Бейелер С.К., Джексон Б. (2002) Подземные индикаторы антропогенного нарушения растительности в длиннолистных сосновых лесах в Форт-Беннинге, Джорджия, США. Ecol Indic 1: 155–170

Статья Google ученый

Damascos MA (1996) Patrones morfologicos y floristicos en los bosques andino-patagónicos de Argentina. Ecol Aust 6: 94–100

Google ученый

Donoso CZ, Donoso P (2006) Nothofagus betuloides (Mirb) Oerst.В: Donoso Zegers C (ed) Las especies arbóreas de los bosques templados de Chile y Argentina autoescología. Мариса Кунео Эдисионес, Вальдивия

Google ученый

Драйсс Л.М., Волин Дж.К. (2013) Влияние фенологии листьев и азота участка на акклиматизацию инвазивных видов в подлеске лиственных лесов умеренного пояса. Для Ecol Manage 296: 1–8

Статья Google ученый

Дюфрен М., Лежандр П. (1997) Видовые сообщества и индикаторные виды: необходимость гибкого асимметричного подхода.Ecol Monog 67: 345–366

Google ученый

Ellenberg H (1996) Vegetation Mitteleuropas mit den Alpen in okologischer Sicht. 5-е издание. Ульмер, Штутгарт.

Ferretti M, Calderisi M, Amoriello T., Bussotti F, Canullo R, Campetella G, Costantini A, Fabbio G, Mosello R (2006) Факторы, влияющие на разнообразие сосудистых видов на участках постоянного мониторинга CONECOFOR. Ann Inst Sper Selv 30: 97–106

Google ученый

Finzi AC, Canham CD, van Breemen N (1998) Взаимодействие деревьев и почвы в лесах умеренного пояса: влияние видов на pH и катионы.Ecol Appl 8 (2): 447–454

Google ученый

Forrester DI, Bonal D, Dawud S, Gessler A, Granier A, Pollastrini M, Grossiord C (2016) Реакция отдельных видов деревьев на засуху не часто коррелирует с разнообразием видов деревьев в европейских лесах. J Appl Ecol 53: 1725–1734

CAS Статья Google ученый

Frangi JL, Barrera MD, Puigdefábregas J, Yapura PF, Arambarri AM, Richter L (2005) Ecología de los bosques de Tierra del Fuego.В: Arturi MF, Frangi JL, Goya JF (eds) Ecología y manejo de los bosques de la Argentina. Национальный университет Ла-Платы, Аргентина

Google ученый

Frazer GW, Fournier RA, Trofymow JA, Gall RJ (2001) Сравнение цифровой и пленочной фотографии «рыбий глаз» для анализа структуры лесного полога и пропускания света в промежутках. Agric For Meteorol 109: 249–263

Статья Google ученый

Галло Е.А., Ленсинас М.В., Мартинес Пастур Г. (2013) Влияние качества участка на разнообразие подлеска в старовозрастных и заготавливаемых лесах. Nothofagus pumilio .Для Syst 22: 25–38

Google ученый

Gazol A, Ibáñez R (2010) Детерминанты, зависящие от масштаба смешанного банка саженцев и саженцев бука и дуба в различных экологических и биотических условиях. Завод Эко 211 (1): 37–48

Артикул Google ученый

Гиллиам Ф.С. (2007) Экологическое значение травяного яруса в лесных экосистемах умеренного пояса. Bioscience 57: 845–858

Статья Google ученый

Грасиа М., Монтане Ф., Пике Дж., Ретана Дж. (2007) Ярусная структура и топографические градиенты, определяющие разнообразие и численность подлеска кустарниковых видов в лесах умеренного пояса в центральных Пиренеях (северо-восточная часть Испании).Для Ecol Manage 242: 391–397

Статья Google ученый

Härdtle W, Oheimb G, von Westphal C (2003) Влияние света и почвенных условий на видовое богатство наземной растительности лиственных лесов в северной Германии (Шлезвиг-Гольштейн). Для Ecol Manage 182: 327–338

Статья Google ученый

Hertel D, Therburg A, Villalba R (2008) Реакция Nothofagus pumilio над и под землей на климатические условия на переходе от границы степного леса к альпийской границе в южной Патагонии, Аргентина.Plant Ecol Divers 1 (1): 21–33

Артикул Google ученый

Хьюстон М.А. (1994) Биологическое разнообразие. Сосуществование видов на меняющихся ландшафтах. Издательство Кембриджского университета, Кембридж, стр. 708

Google ученый

Иванчич Х., Мартинес Пастур Г., Роиг Ф., Баррера М., Пулидо Ф. (2012) Изменения в структуре роста высот в верхних лесах Огненной Земли в связи с изменением климата.Bosque 33 (3): 267–270

Артикул Google ученый

Kreps G, Martínez Pastur G, Peri P (2012) Cambio climático en Patagonia sur. Escenarios futuros en el manejo de los recursos naturales. Ediciones INTA, Буэнос-Айрес.

Кудо Г., Ида Т. Ю., Тани Т. (2008) Взаимосвязи между фенологией, опылением, фотосинтезом и воспроизводством растений подлеска лиственных лесов. Экология 89 (2): 321–331

Статья PubMed Google ученый

Кунинага Т., Хираяма К., Сакимото М. (2015) Отрицательное взаимодействие между пологом и подлеском формирует саженец Fagus crenata в прохладно-умеренном смешанном лесу хвойно-лиственных пород.Завод Ecol 216: 1191–1202

Артикул Google ученый

Ленсинас М.В., Мартинес Пастур Г., Солан Р., Галло Э., Челлини Дж. М. (2008a) Управление лесным хозяйством с переменным удерживающим воздействием на сообщества мохообразных в подлеске Nothofagus pumilio . Форстархив 79: 77–82

Google ученый

Ленсинас М.В., Мартинес Пастур Г., Риверо П., Буссо С. (2008b) Ценность сохранения качества древесины по сравнению с сопутствующим недревесным качеством свидетельствует о разнообразии подлеска в лесах Nothofagus .Biodivers Conserv 17: 2579–2597

Статья Google ученый

Ленсинас М.В., Мартинес Пастур Дж., Галло Э., Челлини Дж. М. (2011) Альтернативные методы лесоводства с переменным сохранением для улучшения сохранения разнообразия подлеска в лесах южной Патагонии. Для Ecol Manage 262: 1236–1250

Статья Google ученый

Márialigeti S, Tinya F, Bidló A, dor P (2016) Экологические факторы, влияющие на состав и разнообразие травяного яруса в смешанных лесах умеренного пояса в Венгрии.Завод Ecol 217: 549–563

Артикул Google ученый

Мартинес Пастур Г., Пери П.Л., Фернандес М.К., Стафиери Г., Ленсинас А. (2002) Изменения в видовом разнообразии подлеска во время цикла лесопользования Nothofagus pumilio . J Для Рез. 7 (3): 2–10

Google ученый

Martínez Pastur G, Cellini JM, Lencinas MV, Barrera M, Peri PL (2011) Параметры окружающей среды, влияющие на регенерацию Nothofagus pumilio в системе с комбинированным агрегированным и диспергированным удерживанием.Для Ecol Manage 261: 178–186

Статья Google ученый

Мартинес Пастур Г., Йордан С., Ленсинас М. В., Солер Р., Иванчич Х., Крепс Г. (2012) Влияние ландшафта и условий микросреды на динамику восстановления в старовозрастных лесах Nothofagus betuloides Южно-Патагонские леса. Завод Биосист 146: 201–213

Артикул Google ученый

Massaccesi G, Roig F, Martínez Pastur G, Barrera M (2008) Модели роста деревьев Nothofagus pumilio вдоль высотных градиентов на Огненной Земле, Аргентина.Деревья 22 (2): 245–255

CAS Статья Google ученый

Matteri C, Schiavone M (2002) Catálogo de los musgos (Bryophyta) de la región Fueguina en Argentina y Chile. Revista del Museo Argentino de Ciencias Naturales 4: 111–138

Статья Google ученый

МакКьюн Б., Грейс Дж. Б. (2002) Анализ экологических сообществ. MJM Software Design, Орегон

Google ученый

Миттермайер Р.А., Миттермайер К.Г., Брукс Т.М., Пилигрим Д.Д., Константин В.Р., да Фонсека Г.А.Б., Кормос С. (2003) Сохранение дикой природы и биоразнообразия.PNAS 100 (18): 10309–10313

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Мур Д. (1983) Флора Огненной Земли. Энтони Нельсон, Англия, Ботанический сад Миссури, США

Neirynck J, Mirtcheva S, Sioen G, Lust N (2000) Impact of Tilia platyphyllos Scop., Fraxinus excelsior L., Aceran pseudoplatz , Quercus robur L.и Fagus sylvatica L. по биомассе дождевых червей и физико-химическим свойствам суглинистой почвы. Для Ecol Manage 133: 275–286

Статья Google ученый

Nordén U (1994) Влияние пород широколиственных деревьев на pH и содержание органических веществ в верхних слоях почвы лесов в Скании, Южная Швеция. Scand J For Res 9: 1–8

Статья Google ученый

Promis A, Cruz G, Reif A, Gärtner S (2008) Nothofagus betuloides (MIRB.) Леса OERST 1871 (Fagales: Nothofagaceae) в южной Патагонии и на Огненной Земле. Ann Inst Pat 36: 53–68

Google ученый

Promis A, Gartner S, Reif A, Cruz G (2010) Влияние естественных мелкомасштабных нарушений на солнечную радиацию под пологом и модели регенерации в старовозрастном лесу Nothofagus betuloides в лесу на Огненной Земле, Чили . Allg Forst Jagdztg 181 (3/4): 53–64

Google ученый

Roig F (1998) La Vegetación de la Patagonia.В: Correa M (ed) Flora Patagónica. INTA Colección Científica, Буэнос-Айрес

Google ученый

Симонсон В.Д., Аллен Х.Д., Кумс Д.А. (2014) Избыточность и топографические эффекты на подлеска: доказательства связи между лесами пробкового дуба ( Quercus suber ) на юге Испании. Для Ecol Manage 328: 35–44

Статья Google ученый

Spyreas G, Matthews JW (2006) Природоохранная ценность для флористики, вложенные флоры подлеска и развитие вторичных лесов.Ecol Applic 16: 1351–1366

Артикул Google ученый

Техеда-Крус К., Мельтретер К., Соса В.Дж. (2008) Indicadores ecológicos multitaxonómicos, p. 271–278. В: Manson RH, Hernández-Ortiz V, Gallina S, Mehltreter K (ред.). Agroecosistemas cafetaleros de Veracruz: Biodiversidad, manejo y conservación. Instituto de Ecología e Instituto Nacional de Ecología, Мексика.

Тинья Ф., Эдор П. (2016) Соответствие пространственного рисунка светлой и подлеской растительности в старовозрастном смешанном лесу умеренного пояса.Для Ecol Manage 381: 84–92

Статья Google ученый

Tuhkanen S (1992) Климат Огненной Земли с географической точки зрения растительности и его экологические аналоги в других местах. Акта Бот Фенн 145: 64

Google ученый

Ван Ойен М., Ружье Дж., Смит Р. (2005) Байесовская калибровка технологических моделей леса: устранение разрыва между моделями и данными.Tree Physiol 25: 915–927

Статья PubMed Google ученый

Веблен Т.Т., Эштон Д.Х., Шлегель FM, Веблен А.Т. (1978) Influencia del estrato arbóreo sobre los estratos inferiores en un bosque, mixto, perenni-caducifolio de Antillanca, Осорно, Чили. C. D. Oxf .: 182.4. Bosque 2 (2): 88–104

Артикул Google ученый

Веблен Т.Т., Веблен А.Т., Шлегель FM (1979) Структура подлеска в смешанных вечнозелено-лиственных лесах Nothofagus в Чили.J Ecol 67 (3): 809–823

CAS Статья Google ученый

Ю М., Сун О. Дж. (2013) Влияние типа участка и участка леса на травянистую растительность в лесной экосистеме умеренного пояса. Fore Ecol Manage 300: 14–20

Статья Google ученый

Дистанционное зондирование | Бесплатный полнотекстовый | Данные Sentinel-2 в оценке воздействия нарушений на лесную растительность

1.Введение

Одной из возможностей мониторинга и оценки лесной растительности является использование методов наблюдения Земли (ЭО). ЭО предоставляет уникальную информацию для наблюдения за динамическими явлениями на поверхности Земли [1]. Спутники оснащены различными датчиками, которые предоставляют изображения с информацией, недоступной человеческому глазу. Это особенно полезно для обнаружения ранних стадий нарушения лесов, когда нет визуальных признаков повреждения [2]. Одним из наиболее полезных результатов, основанных на ЭО, являются всемирные базы данных о состоянии и изменениях лесных площадей [3], базы данных изменений лесных площадей для Восточной Европы [4] или базы данных систематически учитываемых изменений в лесных площадях, как в Северная и Южная Америка (напр.г., в Бразилии и Колумбии) [1,5,6,7,8,9]. Другие авторы оценивали лес, пораженный короедами, с индексами растительности из изображений Landsat, и последующая пиксельная классификация достигла общей точности 80–82% [10] или сосредоточилась на классификации трех категорий леса с использованием классификатора максимального правдоподобия: здоровые деревья, поврежденные деревья и луга [11]. Сама беда лесного короеда может быть разделена на зеленую атаку (без видимых повреждений), за которой следует красная атака (первая видимая фаза гибели деревьев) и, наконец, серая атака (мертвые деревья).Этот метод успешно отделил деревья с красной атакой от здоровых деревьев и лугов с помощью RGI (красный зеленый индекс) и отражательной способности в зеленой полосе с общей точностью классификации 86%. Эффект диапазона SWIR (коротковолнового инфракрасного излучения) был продемонстрирован при обнаружении нарушений лесов с использованием методов временных рядов (TS) [12]. В Центральной Европе оценки состояния и изменений лесной растительности с использованием Landsat были представлены во многих исследованиях [13,14,15,16]. Данные ЭО часто использовались при оценке лесов в Чехии, которые боролись с долгосрочными нарушениями (ветровые стихийные бедствия или последующие нашествия короедов) [17,18,19,20,21].Для определения состояния и изменений лесной растительности по спутниковым снимкам ключевую информацию находили в спектральных свойствах изученных видов растительности [22]. Пригодность мультиспектральных данных и рассчитанных на их основе индексов растительности может различаться в зависимости от мониторинга лесной растительности и того, как это было доказано в различных исследованиях [20,23,24,25,26,27,28]. Остается без ответа вопрос о том, какие реальные спектральные различия, измеренные в течение наблюдаемых лет, важны для определения характеристик и отдельных фаз нарушения лесов.Методы TS часто используются для оценки изменений леса. Для целей TS можно использовать весь спектр спутниковых данных. При выборе типа данных необходимо учитывать наличие и пригодность изображений, особенно с точки зрения времени, радиометрического и пространственного разрешения [29]. Благодаря доступности архива свободного доступа архив спутниковых изображений Landsat является одним из них. наиболее часто используемых архивов по широкому кругу дисциплин [30]. Данные Landsat предоставляют диапазоны видимого, ближнего инфракрасного (ближнего инфракрасного) диапазона и SWIR, которые часто использовались при оценке деградации лесов, затронутой возмущением, например.г., гибель короеда. Данные Landsat TM оказались эффективными для обнаружения фазы красной атаки беспокойства короеда [31]. С временной точки зрения целесообразно использовать данные миссии Landsat для более длинных TS, тем более что их временной охват превышает 40 лет. Однако, если посмотреть на количество снимков в год, 16-дневное временное разрешение является ограничивающим фактором, который еще ниже из-за облачности, особенно в горных районах [1,30]. В случае, когда изображений в течение года всего несколько, часто используется только одно выбранное эталонное изображение в год [19].Некоторые исследования пытались объединить ряд различных типов спутниковых данных, например, Landsat с данными MODIS [32]. В случае длительного периода TS (более 20 лет) различное радиометрическое и спектральное разрешение полученных данных может влиять на результаты TS из-за различных типов датчиков [33]. Программа Copernicus произвела новую революцию в Мониторинг ЭО. ЕКА разрабатывает новые миссии спутников под названием Sentinels специально для оперативных нужд программы Copernicus.Изображения получены через две параллельные миссии 2A и 2B, и в случае перекрывающихся сцен временное разрешение составляет менее пяти дней [34]. Набор мультиспектральных оптических данных Sentinel-2 теперь доступен с целью предоставить данные с лучшим разрешением (пространственным, временным и спектральным), чем традиционные данные, такие как Landsat. Данные Sentinel-2 доступны с 2015 года; следовательно, архив готов к тестированию с анализом TS. Спектральные индексы растительности, рассчитанные с помощью Sentinel-2, имеют потенциал для картирования и обнаружения изменений, вызванных нападением короеда, особенно на основе полос красного края или связанных с водой индексов.Эти изменения ограниченно обнаруживаются спутником Landsat-8 из-за более низкого спектрального и пространственного разрешения датчика OLI; см. сопоставимое исследование [2] с точностью 67% для Sentinel-2 и 36% для Landsat 8. Для TS данных Sentinel-2 было написано несколько статей, например, посвященных картированию растительных сообществ пойменных лугов, где авторы имели дело с изменчивостью содержания воды с помощью TS, особенно с TS, используя машину опорных векторов и случайные классификаторы лесов [35].Другие авторы [36] сосредоточились на наблюдении Хлопкового пояса с использованием TS данных Sentinel-2. Авторы использовали случайную классификацию лесов и несколько видов вегетационных индексов для своего временного обзора. Временное и пространственное разрешение сыграли важную роль в наблюдении TS [37,38,39]. По этой причине было разработано сочетание Landsat 8 и Sentinel-2, называемое согласованными наборами данных [40,41,42]. Для TS Sentinel-2 было написано несколько статей, посвященных лесной растительности, например.g., в котором речь шла о распознавании нездоровых пробковых дубов (Quercus suber) [43]. На основе многокомпонентного сравнения (с использованием индексов вегетации) исследователи обнаружили, что в более влажную часть года различия были небольшими, а в более засушливую часть года (сентябрь и октябрь) различия между здоровыми и нездоровыми. стойки из пробкового дуба были более значимыми. Другое исследование было сосредоточено на росте лесов с использованием Sentinel-2 TS [44] и попыталось определить, как отличить бамбуковые леса (Phyllostachys pubescens) от хвойных или лиственных лесов, используя годовой ход вегетационных индексов (NDVI, NDMI и т. Д.)). Результаты доказывают, что май — лучший месяц, чтобы отличить бамбуковые насаждения от других типов леса. Другое исследование [45] показало, что классификация типов леса методом случайного леса на основе ТС Sentinel-2 доказала высокую актуальность «красных полос». Перспективным методом обработки данных ДЗ являются облачные вычисления. Sentinel Hub — одно из наиболее часто используемых облачных приложений, и это приложение обеспечивает эффективную и удобную для конечного пользователя обработку и анализ данных EO (https: // www.sentinel-hub.com). Это приложение с пользовательским интерфейсом для полуавтоматического анализа спутниковых данных, созданное Sinergise [46]. Эта платформа предоставляет спутниковые изображения из различных миссий, например, Sentinel, Landsat или MODIS. Sentinel Hub позволяет загружать, визуализировать спутниковые изображения, создавать сценарии для расчета индексов растительности, классификации и другие анализы, а также использовать сервисы WMS (веб-картографический сервис) для извлечения выбранных значений для данного участка и периода [ 46,47].Одной из актуальных проблем лесных экосистем Центральной Европы является гибель короедов [18]. Их разрастание тесно связано с изменением климата и распространением в Центральной Европе некоренных хвойных деревьев, например ели (Picea abies) [48]. Это исследование сфокусировано на оценке изменений лесной растительности на отдельных участках Национального парка Низкие Татры (Словакия) и Национального парка Шумава (Чехия) с использованием методов TS. Анализ TS основан на изображениях Sentinel-2 (описание в таблице A1; сравнение с данными Landsat).В связи с динамическими изменениями в лесах Чехии и Словакии, которые произошли за последние несколько лет, это подходящая возможность применить Sentinel-2 TS для обнаружения тревожных событий (короед) и оценки состояния здоровья леса во время отдельные стадии нарушения (состояние леса до, во время и после нарушений). С этой точки зрения основная цель и новизна данного исследования заключается в использовании и тестировании данных Sentinel-2 для оценки динамических изменений лесов.Выбранные индексы растительности и их траектории TS были интерпретированы и подтверждены в отношении данных in situ, исследованных в ходе полевых исследований или предоставленных Администрацией национальных парков. В процессе сбора и оценки данных мы сотрудничали с Национальным парком Низкие Татры и Национальным парком Шумава. Важной частью этого исследования является оценка применимости данных EO / Sentinel-2 и методов в управлении лесами и охране природы национальных парков.По этой причине использовались методы больших данных / облачных данных Sentinel Hub.

Основными целями данного исследования были:

• Проверить данные Sentinel-2 в анализе TS для выбранных тематических исследований в Чехии и Словакии в течение трехлетнего периода 2017–2019 гг. И оценить преимущества Данные Sentinel-2 для мониторинга изменений лесов.

• Сравнить временное и пространственное разрешение Sentinel-2 и Landsat для анализа TS лесной растительности в горных районах.

• Оценить актуальность индексов растительности при изучении изменений лесов и состояния лесной растительности с использованием данных Sentinel-2.

• Выполнить анализ TS и сравнить результаты в различных типах территорий, затронутых нашествием короеда (нарушенные и возобновляющиеся лесные экосистемы).

• Чтобы обсудить положительные стороны и перспективы данных Sentinel-2 в TS изменений леса по сравнению с традиционными используемыми данными, e.г., Landsat.

• Для обработки спутниковых данных и выполнения анализа в облачном инструменте (Sentinel Hub), а также для обсуждения положительных и отрицательных сторон облачных систем для конечных пользователей в области исследований и управления лесным хозяйством.

Мы хотели бы дать ответы на следующие вопросы исследования:

• Каковы основные положительные стороны данных Sentinel-2 в оценке лесной растительности, затронутой нарушениями? Какие изменения в лесу можно обнаружить с помощью Sentinel-2? Какие плюсы использования данных Sentinel-2 в TS по сравнению с традиционными спутниковыми данными, e.г., Landsat?

• Каковы преимущества обработки и анализа данных в облачном инструменте (Sentinel Hub)?

• Какие индексы растительности, полученные из полос данных Sentinel-2, полезны для обнаружения леса, пораженного нашествием короеда? Какие индексы растительности, основанные на этих данных, могут выявить возникшие нарушения и отдельные фазы восстановления лесов в горных районах? Могут ли индексы растительности, традиционно используемые для данных Landsat, использоваться для данных Sentinel-2?

• Сколько безоблачных изображений Sentinel-2 доступно для анализа TS в наших тематических исследованиях горных районов ежегодно? Каков прогресс доступности данных за год по сравнению с данными Landsat? Достаточно ли временного разрешения данных Sentinel-2 для обнаружения изменений и состояния леса в течение года?

4.Обсуждение

Явления нарушений, такие как короед и ветровые бедствия, являются одной из самых актуальных проблем в лесных экосистемах Центральной Европы. Их разрастание тесно связано с изменениями климата и распространением в Центральной Европе некоренных хвойных деревьев, например ели (Picea abies). В обоих наблюдаемых национальных парках (Национальный парк Шумава в Чехии и НАПАНТ в Словакии) ель является доминирующим деревом. Доминирование еловых монокультур было вызвано лесоводами из-за рыночно ориентированного ведения лесного хозяйства.В настоящее время в условиях новой экологической политики и под влиянием климатических изменений национальные парки внедрили более экологически ориентированные и устойчивые методы управления, часто без какого-либо вмешательства лесников. Основная задача этого управления — создание естественного и экологически устойчивого леса. Монокультуры ели, более высокие температуры и абиотические бедствия могут создать подходящие условия для бедствий короеда. С другой стороны, устойчивое управление должно создать естественную экосистему, подходящую для более богатых сообществ видов по сравнению с монокультурой ели.

В настоящее время видны различные подходы к управлению лесным хозяйством в Европе. Леса в национальном парке НАПАНТ в основном относятся к ведению лесного хозяйства. В случае возникновения очага короеда, владелец / администратор обязан вырубить лес в зоне вмешательства. Обычно после стихийного бедствия вырубается более половины мертвых деревьев. Однако около 15% территории национального парка в настоящее время находится в режиме невмешательства (SA4 _recov ). В случае появления короеда существует обязанность владельца / администратора вырубить лес в зоне вмешательства, несмотря на значение некоммерческих функций в природоохранном управлении лесами.С другой стороны, в НП Сумана была внедрена практика управления лесами с очень ограниченным вмешательством. Таким образом, в НП Шумава на преобладающей территории происходит естественное обновление лесной экосистемы. На восстановительных территориях видны новые небольшие деревья и кустарники (SA2 _recov ).

В этом исследовании мы применили и протестировали данные Sentinel-2 для оценки и мониторинга лесных экосистем в Чехии (национальный парк Шумава) и Словакии (NAPANT).В связи с динамическими изменениями в лесах в Чехии и Словакии, которые произошли за последние годы, существует подходящая возможность применить Sentinel-2 TS для обнаружения тревожных событий (короед) и оценки состояния леса (состояние леса). до, во время и после тревожных событий). По этой причине исследуемые территории представляют собой лес в различных условиях и развитии (мертвые деревья после вспышки короеда, режим восстановления после вспышки короеда и лесная растительность без какого-либо значительного влияния).Выбранные индексы растительности и их траектории TS были интерпретированы и подтверждены в отношении данных in situ, исследованных в ходе полевых исследований или предоставленных администрацией национальных парков, и аэрофотоснимков.

Программа Copernicus с данными Sentinel-2 открыла новые возможности и перспективы в мониторинге ландшафта / лесов. Благодаря временному и пространственному разрешению нам удалось получить короткую TS для наблюдения за состоянием здоровья и изменениями в лесных экосистемах [59].Благодаря расширенным параметрам миссии Sentinel (например, два спутника — Sentinel A и Sentinel B), данные Sentinel-2 позволили нам многократно наблюдать за состоянием и изменениями растительности за короткий период времени (5 дней или меньше). с мультиспектральными характеристиками в данных (13 полос). TS Sentinel с более высоким временным и пространственным разрешением, несомненно, был одним из самых больших преимуществ изучения региональных или даже глобальных явлений [60]. Другие авторы [61] утверждали, что вероятность того, что спутник Landsat 8 получит безоблачные пиксели в летний период в США.С. было 0,78.

Этот факт часто побуждал исследователей изучать изменения в лесу в течение нескольких лет, а не по сезонам года (фенофазы). В этом исследовании мы доказали, что данные Sentinel-2 имели значительно более высокую плотность в TS по сравнению с данными Landsat 8. Очевидно, что намного больше изображений Sentinel-2 (2A и 2B), по сравнению со снимками Landsat, было доступно для всех областей в 2018 и 2019 годах. В связи с запуском Sentinel-2B временное разрешение быстро увеличилось.Это разрешение является очень важным фактором для оценки леса с динамическими изменениями (например, в условиях нарушения) в горных районах, где облачный покров является актуальной проблемой. Данные Sentinel-2 открывают новое измерение в доступности данных, а их улучшенное временное разрешение с использованием двух спутников (2A и 2B) больше подходит для мониторинга динамики лесов, чем традиционно используемые данные Landsat.

Что касается обработки данных с более низким временным разрешением (например, Landsat), необходимо несколько этапов предварительной обработки для подготовки наборов данных.Для получения сопоставимых результатов необходимо использовать методы нормализации [20,62,63], методы перекрестной калибровки, специализированные алгоритмы согласования (например, LandsatLinkr [29]) или использовать другие методы (например, LandTrendr [64,65]). Однако в случае данных Sentinel-2 методы нормализации не были необходимы для обработки TS при использовании всего набора измерений с высоким временным разрешением (выбросы, вызванные неоднородностью окружающей среды в течение года, могут быть отфильтрованы — или данные могут подойти).

Данные Sentinel-2 дали гораздо более четкие изображения, особенно из-за 10-метрового диапазона разрешения. Такое пространственное разрешение позволило нам лучше распознавать отдельные элементы, такие как поврежденные леса, тени, облака и другие покровы. Однако из-за низкого пространственного разрешения Landsat обнаружить перистые облака было сложно. Для данных Landsat 8 можно было использовать панхроматические изображения с разрешением 15 м и применять методы панорамирования для получения лучшего пространственного разрешения. Однако это было возможно только для видимых полос, и этот подход требовал сложной предварительной обработки изображения.

Облачное приложение Sentinel Hub использовалось для обработки и анализа данных Sentinel-2. Облачные инструменты позволили обеспечить эффективную и удобную для конечного пользователя обработку и анализ данных EO. Преимуществом Sentinel Hub была возможность подготовить и использовать сценарии в Configuration Utility для полуавтоматической обработки данных и расчета индексов на основе данных Sentinel-2 (NDVI, NDMI, зеленая шапка с кисточкой и кисточкой). влажность крышки).Sentinel Hub также содержал подготовленные алгоритмы расчета наиболее часто используемых индексов. Также было возможно выполнение классификации землепользования / земного покрова и другого анализа изображений. Для расчета индексов вегетации в этом исследовании было написано несколько сценариев программирования с использованием языка JavaScript.

Влияние нарушений на лесную растительность оценивалось с помощью индексов NDVI, NDMI, TCG и TCW. Тенденции (сходства и различия) значений исследуемых показателей анализировали с помощью методов TS.Мы обнаружили, что индексы растительности NDVI, NDMI и TCW позволяют различать здоровые и нарушенные / поврежденные леса, и они дали наиболее важные результаты для исследовательских целей этого исследования. Отражательная способность здоровой лесной растительности была выше в ближнем ИК-диапазоне, чем в SWIR; однако отражательная способность SWIR была выше в случае помех. Этот аспект сыграл важную роль, поскольку полосы SWIR чутко реагировали на деградацию леса. Индекс NDMI с использованием диапазона SWIR, очевидно, смог точно различить отдельные типы областей, затронутых нарушениями (без нарушения и с нарушением или после нарушения в отдельных фазах восстановления).Значения нарушенных участков и участков восстановления не перекрывались с ненарушенными участками и образуют определенные группы на диаграмме TS.

Значения NDMI для незатронутых областей варьировались приблизительно от 0,37 до 0,69, а для областей, затронутых возмущениями или в фазе восстановления, были явно более низкие значения NDMI в диапазоне от -0,12 до 0,28. Ортогональный индекс TCW имел аналогичную способность; тем не менее, он не смог точно различить фазы / участки нарушения и восстановления.Значения индекса TCW были задокументированы от -0,10 до 0,00 в нарушенных и восстановительных участках и от 0,00 до 0,03 для непораженных участков. Индекс NDVI, который основан на соотношении видимой полосы и NIR, смог отразить эволюцию растений и кустарников, которые быстро покрыли нарушенную территорию во время фазы восстановления (см. Рисунок 10). Что касается индекса TCG, возможности этого индекса позволили нам обнаружить нарушения в фазе серой атаки. Однако было трудно различить разные фазы восстановления исследуемых территорий.Наши результаты согласуются с сопоставимыми исследованиями [66,67]. Новизна этого исследования заключалась в использовании и тестировании данных Sentinel-2 в TS динамических изменений леса; Таким образом, мы не нашли никаких аналогичных исследований со сравнимыми результатами стоимостных индексов в анализе TS на основе данных Sentinel-2.

Важным выводом, полученным в ходе этого исследования, была высокая актуальность данных о методах ведения лесного хозяйства в национальных парках. Данные, содержащиеся в планах управления лесами, оказались отличным источником для подтверждения результатов расследования EO / TS.Планы управления лесами содержали широкий спектр полезной информации, и эта информация регулярно обновляется. Данные исследований in situ предоставили очень подробные данные о восстановлении лесных экосистем, особенно в том, что касается восстановления травянистого и древесного подроста.

Использование данных Sentinel-2 в оценке лесной растительности и последствий дифференцированных подходов к природоохранной и лесохозяйственной деятельности предоставило отличные возможности и возможности для мониторинга леса и внедрения данных EO и метода TS. в защиту и управление лесом.Кроме того, новый Landsat 9 (с аналогичным датчиком OLI и TIRS) будет отправлен на орбиту в ближайшее время (март 2021 года). Если Landsat 8 все еще будет работать в последующие годы, новое временное покрытие изображений Landsat будет выше (аналогично Sentinel-2A и Sentinel-2B). Гармонизация данных Landsat 8 (или Landsat 9) и Sentinel-2 также может увеличить временной охват TS [68]. Возможности увеличения временного и спектрального разрешения можно увидеть в объединении данных оптических данных и данных SAR (например,г., Sentinel-1 и Sentinel-2). С методической точки зрения было бы полезно протестировать приложение облачного Google Earth Engine (GEE), которое позволяет проводить аналогичный анализ данных EO, например Sentinel Hub. Другая идея — провести сравнительное исследование в других национальных парках Европы и подтвердить наши достигнутые результаты в различных лесных экосистемах.

Молекулярный фенотип E. coli в различных условиях роста

План эксперимента и сбор данных

Мы вырастили несколько культур E.coli REL606 из одного и того же стада в различных условиях роста. Мы измерили содержание РНК во всех условиях и соответствующее содержание белка примерно для 2/3 условий (рис. 1 и дополнительная таблица S1). Мы также измерили центральные метаболические потоки для подмножества условий, используя глюкозу в качестве источника углерода. Результаты одного из этих состояний, длительного голодания по глюкозе, были представлены ранее ¹⁰ . Условия, не описанные ранее, включают один дополнительный эксперимент по голоданию с использованием глицерина вместо глюкозы в качестве источника углерода, экспоненциальную и стационарную фазу культур с использованием глюконата или лактата в качестве источника углерода, а также условия, изменяющие концентрации Mg ²⁺ и Na ⁺ .

Рисунок 1: Экспериментальная установка.

Мы провели семь различных экспериментов, в которых мы варьировали продолжительность роста и временную плотность выборки, источник углерода и концентрации ионов. Для каждого экспериментального условия бактерии выращивали в трех биологических повторностях. Условия, перечисленные несколько раз, представляют собой независимые копии этих условий. Впоследствии мы выполнили полнотранскриптомную РНК-Seq для всех экспериментальных условий и масс-спектрометрию для большинства из них.(Для эксперимента с низким содержанием магния протеомика не проводилась.) Мы рассмотрели четыре различных источника углерода: глюкозу, глицерин, глюконат и лактат; мы также рассматривали высокий уровень натрия и как низкий, так и высокий уровень магния. Для экспериментов с динамикой и источниками углерода мы использовали Na ⁺ (5 мМ) и Mg ²⁺ (0,8 мМ) на базовом уровне (обозначено [*] в экспериментах с натрием и магнием).

Измерения содержания РНК и белка проводили, как описано ранее ¹⁰ .Все полученные наборы данных были проверены на качество, нормализованы и преобразованы в логарифм. Наш окончательный набор данных состоял из 152 образцов РНК, 105 образцов белка и 65 образцов потока (дополнительная таблица S1). 59 образцов флюса связаны с экспериментами с высоким содержанием Mg ²⁺ и высоким содержанием Na ⁺ .

Наши необработанные данные о последовательности РНК и белков охватывают 4196 различных мРНК и белков, а наши данные о потоках охватывают 13 различных метаболических реакций. Все файлы необработанных данных доступны в соответствующих репозиториях (подробности см. В разделе «Методы»), а окончательные обработанные данные доступны в дополнительных таблицах S2, S3 и S4.

Наконец, мы измерили время удвоения в экспоненциальной фазе для всех экспериментальных условий (дополнительная таблица S5). Мы обнаружили, что время удвоения варьировалось от 50 до 100 минут в различных условиях (рис. 2). Рост был самым быстрым, когда в качестве источника углерода использовалась глюкоза, и самым медленным, когда источником углерода была лактоза. Рост также снижался при высоких концентрациях Na ⁺ и очень высоких или низких концентрациях Mg ²⁺ . Неожиданно мы обнаружили широкий диапазон концентраций Mg ²⁺ (0.От 02 до 200 мМ), в которых скорость роста практически не изменилась (рис. 2).

Рис. 2: Время удвоения при различных условиях роста.

Мы измерили время удвоения в экспоненциальной фазе для всех условий роста. Красные точки и пунктирные оранжевые линии представляют время удвоения при основных условиях (глюкоза, 5 мМ Na ⁺ , 0,8 мМ Mg ²⁺ ). Время удвоения измерялось в трех экземплярах, и планки ошибок представляют собой 95% доверительные интервалы среднего. ( A ) Время удвоения по отношению к источникам углерода.( B ) Время удвоения по отношению к концентрациям Mg ²⁺ . ( C ) Время удвоения по отношению к концентрациям Na ⁺ .

Широкие тенденции экспрессии генов различаются между мРНК и белками

Чтобы определить общие тенденции экспрессии генов среди различных условий роста, мы выполнили иерархическую кластеризацию как по мРНК, так и по количеству белков (рис. 3 и 4). Для мРНК мы обнаружили, что различия в экспрессии генов в первую очередь обусловлены фазой роста (экспоненциальный vs.стационарный / поздний стационарный). Почти все экспоненциальные образцы сгруппированы в одну группу, отдельно от подавляющего большинства стационарных и поздне-стационарных образцов (рис. 3). Уровни Mg ²⁺ , уровни Na ​​ ⁺ и источник углерода имели меньшее влияние на результаты кластеризации. Результаты были разными для содержания белка (рис. 4), где фаза роста мало влияла на кластеризацию, и вместо этого образцы, казалось, группировались вместе по уровням Na ⁺ и источнику углерода.

Рисунок 3: Кластеризация обилия мРНК.

Тепловая карта показывает 4196 количеств мРНК для каждого из 152 образцов, сгруппированных как по схожести генов, так и по схожести между образцами. Условия роста для каждого образца обозначены цветовой кодировкой в ​​верхней части тепловой карты; цветовая кодировка определяется в легенде внизу.

Рис. 4: Кластеризация содержания белка.

Тепловая карта показывает 4196 содержаний белка для каждого из 105 образцов, сгруппированных как по схожести генов, так и по схожести между образцами.Условия роста для каждого образца обозначены цветовой кодировкой в ​​верхней части тепловой карты; цветовая кодировка определяется в легенде внизу.

Для количественной оценки моделей кластеризации мРНК и содержания белка мы определили показатель, который измерял, насколько сильно кластеризована данная переменная среды роста (фаза роста, уровень Mg ²⁺ , уровень Na ⁺ , источник углерода). относительно случайного ожидания отсутствия кластеризации. Для каждой переменной мы рассчитали среднее кофенетическое расстояние между всеми парами, соответствующими одному и тому же условию (например,g., для фазы роста все пары отбирались в экспоненциальной фазе и все пары отбирались в стационарной / поздней стационарной фазе). Кофенетическое расстояние определяется как высота дендрограммы, полученной в результате иерархической кластеризации двух выбранных листьев до точки, где две ветви сливаются, и широко используется для количественной оценки того, насколько тесно связаны любые два листа в дендограмме кластеризации ^{15 , 16} . Мы сгенерировали нулевые распределения кофенетических расстояний в предположении отсутствия кластеризации путем повторной выборки средних кофенетических расстояний из дендограмм с перетасованными назначениями листьев, а затем преобразовали каждое наблюдаемое среднее коенетическое расстояние в балл z , используя среднее значение и дисперсию соответствующего нулевого значения. распределение.Таким образом, мы провели непараметрический тест со случайной перестановкой, в котором мы определили нулевое распределение нашей тестовой статистики путем повторной выборки. Оценка z ниже -1,96 указывает на то, что содержания мРНК или белка значительно сгруппированы по соответствующей переменной.

Мы обнаружили, что содержания мРНК были значительно сгруппированы по фазе роста, с оценкой z , равной -30,98, и по уровню Mg ²⁺ , с оценкой z , равной -3,21 (Таблица 1). Оценка z для уровня Na ⁺ и источника углерода составила -1.89 и 1,21 соответственно, которые существенно не отличаются от нуля. Более того, когда мы вычислили балл z для номера партии, мы обнаружили, что эффекты партии не оказали значительного влияния на численность мРНК, с z = -1,43. Номера партий представляют культуры, выращенные одновременно и параллельно.

Таблица 1 Кластеризация содержания мРНК и белка в зависимости от различных условий роста.

Для содержания белка переменный источник углерода был значительно сгруппирован с z-значением -2.79 и другие переменные уровни Na ​​ ⁺ , фаза роста и уровни Mg ²⁺ не были значительно сгруппированы, с z-баллами -1,74, -1,27 и -0,5, соответственно (Таблица 1). Номер партии имел z-показатель -20,54, что означает, что в данных по белку присутствовали сильные эффекты партии. Как правило, эффекты партии могут представлять собой колебания температуры инкубатора, незначительные различия в составе питательной среды или качестве воды, эффекты восстановления первоначального инокулята клеток или эффекты подготовки и анализа образцов, среди других возможностей.Здесь, поскольку пакетные эффекты были настолько ярко выражены в данных протеомики, а не в данных мРНК, мы подозреваем, что они были в первую очередь вызваны подготовкой и анализом протеомных образцов.

Таким образом, содержание мРНК было сгруппировано по фазе роста и уровням Mg ²⁺ , тогда как содержание белка было сгруппировано по источнику углерода. На содержание белка также сильно влияли эффекты партии, в отличие от данных мРНК (таблица 1, дополнительная таблица S6 и S7).

Идентификация дифференциально экспрессируемых генов

Затем мы спросили, при каких условиях и в какой степени была изменена экспрессия РНК и белка.Чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые мРНК и белки, мы использовали DESeq2 ¹⁷ . Поскольку подробное сравнение экспоненциальной и стационарной фаз было опубликовано ранее для эксперимента с динамикой глюкозы ¹⁰ , здесь мы сосредоточились на различиях между концентрациями ионов или источниками углерода в экспоненциальной или стационарной фазе.

Для каждой фазы роста мы определили исходное условие базового уровня как рост глюкозы с 5 мМ Na ⁺ и 0.8 мМ Mg ²⁺ . Это базовый состав среды, используемой в образцах зависимости глюкозы от времени ¹⁰ . Затем мы сравнили содержание РНК и белка между этим эталонным условием и альтернативными условиями (различные источники углерода, повышенный уровень Na ⁺ и повышенный или пониженный уровень Mg ²⁺ ) отдельно для каждой фазы роста (дополнительная таблица S8).

Мы определили значительно дифференцированно экспрессируемые гены как гены, численность которых имела как минимум двукратное изменение (log ₂ -кратное изменение> 1) между эталонным условием и выбранным экспериментальным условием, с частотой ложного обнаружения (FDR). исправленное значение P <0.05. Мы обнаружили, что количество существенно дифференциально экспрессируемых мРНК и белков существенно различается между экспоненциальной и стационарной фазами, а также между мРНК и белками (рис. 5 и дополнительная таблица S9). В целом в стационарной фазе было меньше дифференциально экспрессируемых генов, чем в экспоненциальной фазе. Кроме того, изобилие белка показало наиболее дифференцированную регуляцию для высокого уровня Na ⁺ и для источников углерода глицерина и лактата, тогда как мРНК показала наиболее дифференцированное регулирование для высоких уровней Na ⁺ в стационарной фазе и для низкого Mg ²⁺ уровней и для источников углерода глицерина и лактата в экспоненциальной фазе (рис.5).

Рисунок 5: Количество дифференциально экспрессируемых генов в различных условиях.

Мы отдельно проанализировали содержание мРНК и белка, как для экспоненциальной, так и для стационарной фазы роста. Во всех четырех случаях уровни экспрессии генов сравнивали с соответствующими условиями с глюкозой в качестве источника углерода и исходными уровнями натрия и магния. Было определено, что дифференциально экспрессируемые гены имеют как минимум двукратное изменение относительно исходного уровня и коэффициент ложного обнаружения <0.05. Источники углерода сокращены следующим образом: «Gly»: глицерин, «Glc»: глюконат, «Lac»: лактат.

Затем мы спросили, насколько перекрываются по-разному экспрессируемые гены в различных условиях роста. Чтобы упростить этот анализ, мы не различали гены с повышенной или пониженной регуляцией, и мы объединили низкий и высокий Mg ²⁺ в одну группу «Mg стресс», а глицерин, лактат и глюконат в одну группу «источник углерода». . (Обратите внимание, что дифференциально экспрессируемые гены все еще были идентифицированы для отдельных условий, как описано выше, и были объединены в «стресс Mg» и «источник углерода» только для окончательного сравнения).На уровне мРНК наблюдалось некоторое перекрытие (21,7%) между источником углерода и стрессом Mg ²⁺ в экспоненциальной фазе. Все остальные перекрытия минимальны, ~ 5% или меньше (рис. 6). На уровне белка наблюдалось перекрытие между стрессом Na ⁺ и источником углерода (15,6% в экспоненциальной фазе, 10,7% в стационарной фазе), в то время как все другие перекрытия также были минимальными, ~ 5% или меньше (рис. 6).

Фигура 6: Перекрытие дифференциально экспрессируемых генов в разных условиях.

Для всех дифференциально экспрессируемых генов (обозначенных на рис.5), мы определили, в какой степени они были уникальными для конкретных условий или появлялись в нескольких условиях. Для простоты мы здесь сгруппировали все эксперименты с источниками углерода, все эксперименты с натрием и все эксперименты с магнием в одну группу. В целом, мы обнаружили относительно небольшое совпадение дифференциально экспрессируемых генов среди этих состояний. ( A ) мРНК, экспоненциальная фаза. ( B ) белок, экспоненциальная фаза. ( C ) мРНК, стационарная фаза. ( D ) белок, стационарная фаза.

Мы также идентифицировали значительно измененные биологические пути и молекулярную активность генных продуктов (дополнительная таблица S10). Мы использовали Киотскую энциклопедию генов и геномов (KEGG) ¹⁸ для биологических путей и аннотаций Консорциума генных онтологий (GO) для молекулярных функций ¹⁹ . На Рисунке 7 и Дополнительном Рисунке 1 показаны 5 основных существенно измененных биологических путей (как определено в базе данных KEGG) и молекулярные функции (как определено аннотациями GO) в различных условиях, соответственно, как определено DAVID ²⁰ .Во всех случаях мы использовали порог 0,05 для значений P с поправкой на частоту ложного обнаружения (FDR), чтобы идентифицировать важные аннотации. Мы обнаружили многочисленные значительно измененные молекулярные функции путей KEGG (рис. 7) (дополнительный рисунок S1).

Фигура 7. Значительно дифференциально экспрессируемые пути KEGG.

Для каждого состояния мы показываем топ-5 дифференциально экспрессируемых путей KEGG, определяемых по количеству мРНК или белка. Пустые прямоугольники указывают на то, что дифференциально экспрессируемые пути не обнаружены.Стрелки рядом с названиями путей указывают соотношение генов с повышенной и пониженной регуляцией среди значительно дифференциально экспрессируемых генов этого пути. Одна стрелка вверх указывает на то, что 60% или более генов активируются, две стрелки соответствуют 80% или более генам, а три стрелки соответствуют 95% или более генам, которые подвергаются повышающей регуляции. Точно так же стрелки вниз указывают долю генов с пониженной регуляцией. ( A ) Экспоненциальная фаза. ( B ) Стационарная фаза.

В дополнение к идентификации измененных путей и молекулярной активности, мы идентифицировали отдельные, наиболее дифференцированно экспрессируемые гены, связанные со специфическими путями и / или функциями (дополнительные рисунки S2 – S33).В качестве примера на фиг. 8А показаны дифференциально экспрессируемые мРНК, связанные со значительно измененными путями KEGG при высоких концентрациях Mg ²⁺ в экспоненциальной фазе. Значительно изменены три пути; метаболизм серы и метаболизм азота в основном регулируются, а сборка жгутиков в основном подавляется. Изменения в метаболизме серы в этом состоянии могут отражать связанное увеличение концентрации сульфата (SO ₄ ^2-), поскольку это был противоион в соли, который был добавлен для повышения уровня Mg ²⁺ .Напротив, использование лактата вместо глюкозы в качестве источника углерода вызвало активацию метаболизма пирувата, цитратного цикла и углеродного метаболизма на уровне белка в экспоненциальной фазе (рис. 8B).

Фигура 8: Примеры существенно дифференциально экспрессируемых путей KEGG и связанных генов.

Верхние дифференциально экспрессируемые пути KEGG показаны вдоль оси y , а относительное кратное изменение соответствующих генов показано вдоль оси x .Для каждого пути KEGG мы показываем до 10 наиболее существенно изменяющихся генов. ( A ) Дифференциально экспрессируемые мРНК при высоких уровнях Mg ²⁺ в экспоненциальной фазе по сравнению с контролем образцов на базовом уровне Mg ²⁺ в экспоненциальной фазе. ( B ) Дифференциально экспрессируемые белки под лактатом в качестве источника углерода в экспоненциальной фазе по сравнению с контролем образцов с глюкозой в качестве источника углерода в экспоненциальной фазе. Значительные изменения для всех условий показаны на дополнительных рисунках 2–33.

Наконец, мы спросили, в какой степени дифференциально экспрессируемые гены могут определяться скоростью роста бактерий, измеряемой временем удвоения. Мы повторили наш анализ DeSeq2, но включили в нашу формулу расчета термин, обозначающий время удвоения (см. «Методы»). Мы обнаружили, что в целом различия в этих анализах невелики; наиболее существенно измененные гены при отсутствии контроля времени удвоения являются наиболее значимо измененными генами при контроле времени удвоения (дополнительная таблица S9).Одним из основных исключений было изобилие белка в ответ на различные источники углерода. В этом сценарии при контроле времени удвоения появилось много новых генов, как с точки зрения относительной доли обнаруженных генов, так и с точки зрения абсолютных чисел (дополнительный рисунок S34, дополнительная таблица S11). Мы определили значительно измененные пути, связанные конкретно с этими генами, и обнаружили, что лучшие результаты были связаны с биосинтезом как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах роста (дополнительная таблица 12).

Соотношения метаболических потоков при солевом стрессе

Для экспериментов с высоким содержанием натрия и магния мы также определили метаболические потоки через центральный метаболизм, проанализировав включение ¹³ C в связанные с белком аминокислоты. Здесь мы проанализировали только образцы потока, полученные в экспоненциальной фазе, поскольку образцы стационарной фазы имеют нечеткую интерпретацию ¹⁰ . Для каждого условия образцы потока анализировали в трех экземплярах (за исключением одного, который анализировали только в двух экземплярах), и для каждого образца было измерено 13 различных соотношений потоков.Затем отношения потоков были усреднены по повторам (дополнительный рисунок S35). Мы не увидели значительных изменений в отношениях потоков с увеличением Na ⁺ (линейная регрессия, все P > 0,05 после коррекции FDR, дополнительная таблица S13). Результаты были аналогичными для Mg ²⁺ . В связи с широким диапазоном рассмотренных концентраций Mg ²⁺ , мы регрессировали отношения потоков относительно логарифмически преобразованных концентраций Mg ²⁺ . Опять же, мы не увидели значительных изменений в каком-либо соотношении потоков с увеличением Mg ²⁺ (линейная регрессия, все P > 0.05 после коррекции FDR, дополнительная таблица S13).

Мы также спросили, изменяются ли отношения потоков со временем удвоения, а не с концентрацией ионов, поскольку время удвоения не обязательно является монотонным по концентрации ионов (рис. 2B). Для этого анализа мы объединили все измерения потоков и построили отношения потоков в зависимости от времени удвоения (рис. 9). Опять же, мы не увидели существенной связи между коэффициентами потоков и временем удвоения после коррекции FDR (дополнительная таблица S14). Однако следует отметить, что ответвления эритрозо-4-фосфата от пентозо-5-фосфата и пирувата от малата (верхняя граница) показали значительную взаимосвязь до поправки на множественное тестирование ( P = 0.026 и P = 0,018, соответственно, дополнительная таблица S14), оба обусловлены одной удаленной точкой данных для условий самого медленного роста, при 300 мМ Na ⁺ .

Рис. 9: Коэффициенты магнитного потока в зависимости от времени удвоения.

13 различных соотношений потоков были измерены для различных концентраций Na ⁺ и Mg ²⁺ (дополнительный рисунок 34). Здесь эти отношения потоков показаны как функция соответствующих времен удвоения. Конкретные рассматриваемые потоки и их сокращенные обозначения, используемые здесь, определены в Ref.35. Не было существенной связи между коэффициентами потоков и временем удвоения после поправки на множественные испытания (дополнительная таблица 14).

Регулируемый жиром адаптерный белок Длиш связывает супрессор роста Expanded и контролирует его стабильность и убиквитинирование

% PDF-1.6 % 175 0 объект > эндобдж 28 0 объект > поток doi: 10.1073 / pnas.18118application / pdf

Регулируемый жиром адаптерный белок Dlish связывает супрессор роста Expanded и контролирует его стабильность и убиквитинирование

10.1073 / pnas.18118 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.181182019-01-10false10.1073/pnas.18118

www.pnas.org

www.pnas.org

10.1073 / pnas.181182019-01-10false

www.pnas.org

2021-09-27T14: 08: 31-07: 002021-09-27T14: 08: 31-07: 002019-01-10T03: 54: 02 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W UnicodeAcrobat Distiller 10.0.0 (Windows) uuid: 20489cba-1dd2-11b2-0a00-8f0927fd5800uuid: 20489cbe-1dd2-11b2-0a00-6a0000000000 конечный поток эндобдж 172 0 объект > эндобдж 84 0 объект > эндобдж 93 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / Shading> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 102 0 R / Type / Page >> эндобдж 94 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 114 0 R / Type / Page >> эндобдж 95 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 125 0 R / Type / Page >> эндобдж 96 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 138 0 R / Type / Page >> эндобдж 79 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 80 0 R / Type / Page >> эндобдж 97 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 147 0 R / Type / Page >> эндобдж 206 0 объект > поток HW ێ} & do $ 7OY_6M0: (5 «$ 5ԩbNV] uԩn2I_ ٍ hfI} y1Mw7 4 ^ & P7o O_i% bS: @) lY $ 2xZ | S $ Cw’rS & m ^ d% 000qu ׎ UhCU $ weAc; a6 ~ h! Ww / `X:% 7.vsa + Im2p! lf 05p

Воздушное лазерное сканирование выявляет большие стволы деревьев на лесной подстилке

https://doi.org/10.1016/j.foreco.2021.119225Получить права и контент

Основные моменты

•

Большие стволы упавшие деревья можно идентифицировать по данным воздушного лазерного сканирования.

•

Данные LiDAR средней плотности позволяют обнаруживать экологически наиболее важные стволы.

•

Обнаружение упавших деревьев на основе LiDAR лучше всего работает в старовозрастных лесах.

•

Подлесок отрицательно влияет на обнаружение упавших деревьев на основе LiDAR.

Abstract

Упавшие деревья разлагаются на лесной подстилке и создают среду обитания для многих видов. Таким образом, картирование упавших деревьев позволяет определить наиболее ценные с точки зрения биоразнообразия районы, особенно в бореальных лесах, что дает возможность целенаправленных действий по сохранению и восстановлению. Воздушное лазерное сканирование (ALS) способно охарактеризовать леса и подстилающую топографию.Однако его потенциал для обнаружения и характеристики упавших деревьев в различных условиях бореального леса еще недостаточно изучен. Методы обнаружения упавших деревьев на основе ALS могут улучшить наше понимание пространственно-временных характеристик мертвой древесины на больших ландшафтах. Мы разработали и протестировали автоматический метод картирования отдельных упавших деревьев из облака точек ALS с плотностью точек 15 точек / м ² . Представленный метод обнаруживает упавшие деревья, используя итеративное обнаружение линий Хафа, и очерчивает деревья вокруг обнаруженных линий, используя рост области.Кроме того, мы провели детальную оценку того, как на эффективность обнаружения упавших деревьев на основе ALS влияют характеристики поваленных деревьев и структура растительности вокруг них. Результаты этого исследования показали, что большие поваленные деревья можно с высокой точностью обнаруживать в старовозрастных лесах. Напротив, обнаружение упавших деревьев в молодых управляемых насаждениях оказалось сложной задачей. Представленный метод смог обнаружить 78% самых больших поваленных деревьев (диаметр на высоте груди, DBH> 300 мм), тогда как 30% всех деревьев с DBH более 100 мм были обнаружены.Эффективность метода обнаружения положительно коррелировала как с размером поваленных деревьев, так и с размером живых деревьев, окружающих их. Напротив, производительность отрицательно коррелировала с количеством подлеска, наземной растительности и состоянием гниения поваленных деревьев. Особенно отрицательно на производительность оказали подлесок и наземная растительность, поскольку они закрывали некоторые упавшие деревья и приводили к ложному обнаружению упавших деревьев. Основываясь на результатах этого исследования, сбор информации о поваленных деревьях на основе ALS должен быть сосредоточен на старовозрастных лесах и зрелых управляемых лесах, по крайней мере, с текущей плотностью рабочих точек.

Ключевые слова

Воздушное лазерное сканирование

Обнаружение света и дальность

Мертвый лес

Упавшие деревья

Биоразнообразие

Преобразование Хафа

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2021 Автор (ы). Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Выделение и характеристика тяжелого металла …

Введение

Chlamydomonas reinhardtii — зеленая одноклеточная водоросль, относящаяся к типу Chlorophyta.Это отличная экспериментальная система для биологов-растений, исследователей медицины и биоэнергетики. ^{1 — 3} Chlamydomonas обычно культивируется в лаборатории в трис-ацетат-фосфатной (TAP) среде, которая содержит ацетат в качестве единственного источника углерода. ⁴ При культивировании в TAP, Chlamydomonas может осуществлять чистый биосинтез глюкозы из ацетата в TAP через цикл глиоксилат / C2, не будучи строго зависимым от фотосинтеза для фиксации диоксида углерода. ⁵ Многие аэробные бактерии также могут использовать глиоксилатный цикл для преобразования ацетата в глюкозу. ^{6 , 7} Эти аэробные бактерии способны расти в TAP. Следовательно, иногда мы получаем бактериальное заражение на чашках Chlamydomonas TAP. ^{8 , 9}

Исследование, представленное в этой статье, основано на исследовательском проекте старшеклассников. Этот исследовательский проект был сосредоточен на искоренении бактериального заражения на пластинах Chlamydomonas TAP.Мы наблюдали желто-пигментированное бактериальное загрязнение на планшете TAP штамма Chlamydomonas и выделили бактерию из загрязненного планшета. Мы назвали эту бактерию Clip185 в честь контаминированного штамма Chlamydomonas Library Project (CLiP). Основная цель проекта старшеклассников заключалась в том, чтобы определить специфический антибиотик и его правильную концентрацию, которая устранит контаминацию Clip185, не влияя на рост Chlamydomonas на планшетах со средой TAP.Этот проект исследования микробиологии средней школы был дополнительно расширен двумя студентами из Университета Западной Джорджии для характеристики Clip185 на биохимическом и физиологическом уровнях и определения родовой принадлежности Clip185.

Clip185 очень чувствителен к ванкомицину, но устойчив к другим антибиотикам, нарушающим микробную цитоплазматическую мембрану или трансляцию. Помимо тестирования чувствительности Clip185 к антибиотикам, мы провели несколько анализов роста и основных микробиологических тестов, чтобы охарактеризовать Clip185.Он лучше растет в среде Lysogeny Broth (LB), чем в среде TAP. Clip185 — это аэробная, мезофильная, альфа-гемолитическая, грамположительная палочка с положительным гидролизом крахмала. Clip185 может сбраживать глюкозу и сахарозу, но не лактозу. Это медленный ферментер маннита по сравнению с Staphylococcus aureus при выращивании на солевом агаре с маннитолом (MSA).

Мы частично амплифицировали и секвенировали ген 16S рРНК Clip185. В 2019 году NCBI Basic Local Alignment Search Tool (NCBI-BLAST) анализ частичной последовательности гена 16S рРНК Clip185 показал 99.10% идентичность последовательности с последовательностью гена 16S рРНК штамма PK1-12M Microbacterium binotii (номер доступа: MN428150.1). В ноябре 2019 года мы отправили частичную последовательность гена 16S рРНК Clip185 в NCBI GenBank (номер доступа: MN633284.1). В начале 2021 года анализ BLAST показал, что наилучшим соответствием последовательности частичного гена 16S рРНК Clip185 является последовательность Microbacterium sp. штамм MDP6 (номер доступа: MK128451.1) с 99,33% идентичностью последовательностей.

Род Microbacterium принадлежит семейству Microbacteriaceae отряда Actinomycetales и подотряда Micrococcineae. ¹⁰ Microbacterium впервые была описана Орла-Йенсеном в 1919 году. ¹¹ В 1983 году Collins et al. ¹² исправлено описание рода Microbacterium. В 1998 году Takeuchi & Hatano ¹³ объединили близкородственные роды Microbacterium и Aureobacterium в один род Microbacterium. Представители рода Microbacterium были изолированы из различных источников окружающей среды, включая почву, воду, насекомых растений, клинические образцы, загрязненные тяжелыми металлами участки, глубоководные отложения, молочные продукты и т. Д. ^{10 , 14} Члены филума актинобактерий продуцируют несколько вторичных метаболитов, таких как сидерофоры, антибиотики и терпеноидные пигменты, которые обладают разнообразными биологическими функциями, от поглощения света, защиты от окислительного стресса до придания стабильности мембран. ¹⁵

Clip185 — бактерия с желтым пигментом. Спектрофотометрический анализ экстрагированного желтого пигмента Clip185 показал, что это -циклический каротиноид C ₅₀ , декапреноксантин.C ₅₀ каротиноиды преимущественно обнаруживаются у грамположительных представителей Actinomycetales. ^{16 — 18} У многих актинобактерий биосинтез декапреноксантина не регулируется светом, но у некоторых актинобактерий биосинтез декапреноксантина строго индуцируется под действием света. ¹⁹ Свет индуцирует биосинтез декапреноксантина в Clip185, как и в актинобактериях Corynebacterium glutamicum , ¹⁹ , но индукция слабее, чем у C.глутамикум.

Имеется несколько сообщений о Microbacterium sp. процветает в среде, загрязненной тяжелыми металлами, ^{15 , 20 , 21} восстанавливает тяжелые металлы, такие как шестивалентный хром (Cr ⁶⁺ ) ^{22 — 24} и демонстрирует способность для изменения подвижности тяжелых металлов в загрязненных почвах. ^{25 , 26} Мы проверили способность Clip185 выдерживать стресс тяжелых металлов, вызванный токсичными концентрациями шести тяжелых металлов, а именно цинка (Zn), меди (Cu ²⁺ ), кадмия (Cd), кобальта (Co ^{). 2+} ), никель (Ni ²⁺ ) и шестивалентный хром (Cr ⁶⁺ ).11 из 16 изолятов Microbacterium из загрязненных металлами образцов почвы в Индиане, США, были способны переносить 0,1 мМ кобальта, кадмия и никеля и 0,5–20 мМ Cr (VI). ²⁷ Четыре из этих 16 изолятов Microbacterium не проявили толерантности к кадмию. ²⁷ Clip185 может расти в присутствии 6 мМ хрома, 2 мМ никеля, кадмия и цинка и 0,5 мМ меди и кобальта в среде LB. Осенью 2021 года у нас будет финансирование для полногеномного секвенирования Clip185 с использованием технологии сиквелов PacBio.Анализ данных секвенирования всего генома не только поможет нам идентифицировать гены в Clip185, которые отвечают за устойчивость к антибиотикам, устойчивость к металлам / детоксикацию и выработку каротиноидов C50, но также поможет выяснить, является ли Clip185 новой Microbacterium sp. или новый экологический штамм Microbacterium binotii . В этой статье мы представляем наши исследования по выделению Clip185 и его физиологические и биохимические характеристики.

Методы

Среда для выращивания и культуры

Chlamydomonas штамм 4A + (CC-4051 4A + mt +) дикого типа культивировали в лаборатории на агаре TAP (Центр ресурсов Chlamydomonas) при слабом освещении (15-20 мкмоль м ^-2 с ^-1 ) при 22 ° C.Рецепты среды ТАП описаны в Mitra et al. , 2020. ⁹ 4A + жидкие культуры ТАП выращивали на шейкере при слабом освещении (70-80 мкмоль м ^-2 с ^-1 ) в течение 3 дней для аэрации, как описано в Mitra et al, 2020. ^{8 , 9} Шток Clip185 содержался в лаборатории при тусклом свете (15-30 мкмоль · м ^-2 с ^-1 ) при 22 ° C на агаризованной среде Lysogeny Broth (LB) (Cold Spring Harbor Протоколы). Температуру и интенсивность света для конкретного эксперимента можно найти в разделе результатов этой статьи под описанием конкретных экспериментов.Жидкие культуры Clip185 выращивали в LB на шейкере при 30 ° C-37 ° C для аэрации. В экспериментах использовался свет 1-2 холодных белых люминесцентных ламп. Люксметр LI-250A (LI-COR, Inc., Lincoln, NE) использовался для измерения интенсивности света.

Тестирование антибиотикочувствительности Clip185

Мы протестировали следующие антибиотики: пенициллин; неомицин, хлорамфеникол, полимиксин B и ванкомицин. Антибиотики были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Два разных количества (50 мкг и 100 мкг) каждого из этих пяти антибиотиков были протестированы с использованием диско-диффузионных тестов на чувствительность к антибиотикам Кирби-Бауэра (KB), как описано в протоколе Американского общества микробиологов (ASM) с одной модификацией: мы использовали TAP агаровая среда вместо агаровой среды Мюллера-Хинтона, как указано в ASM.KB тесты 4A + и Clip185 проводили на чашках с ТАП-агаром, как описано в Mitra et al. , 2020. ^{9, 28 , 29} 12-часовую жидкую культуру LB Clip185 использовали для посева на содержащие антибиотик планшеты TAP. Планшеты с антибиотиками инкубировали при 22 ° C. Пластины Clip185 и Chlamydomonas были визуализированы через 7 дней инкубации. Диаметр зон запретов измерялся в Microsoft PowerPoint путем импортирования бесплатной линейки Google, доступной в Chrome.Средние значения и стандартные отклонения были рассчитаны с использованием Microsoft Excel. T-критерий Microsoft Excels: инструмент «Парные две выборки для средних» в пакете инструментов анализа использовался для статистического анализа данных с использованием трех биологических повторов на эксперимент (каждый с тремя внутренними повторами). Чтобы проверить эффективность ванкомицина в качестве сильнодействующего антибиотика в устранении загрязнения Clip185 на чашках TAP Chlamydomonas , штаммы Clip185 и 4A + совместно наносили штрихами на чашки со средой TAP, содержащие 50 мкг / мл ванкомицина.Планшеты с полосами TAP + ванкомицин визуализировали после инкубации при 22 ° C в течение 2,5 недель. Мы выбрали 2,5-недельный инкубационный период более 7 дней в этом эксперименте по подтверждению эффективности ванкомицина, чтобы убедиться, что выбранное количество ванкомицина является бактерицидным по отношению к Clip185, а не бактериостатическим.

Анализ роста Clip185

Рост при различных температурах : Clip185 наносили штрихами на агар LB и агар TAP, приготовленные в нашей лаборатории, и планшеты со средой инкубировали при 22 ° C и 37 ° C.Чашки с LB-агаром и ТАП-агаром визуализировали через 3 дня и 7 дней роста, соответственно. Рост Clip185 на чашках со средой LB отслеживали в течение 3 дней, а рост Clip185 на чашках со средой TAP — в течение 7 дней, потому что мы наблюдали, что Clip185 растет медленно в среде TAP по сравнению со средой LB. В эксперименте использовали три биологических повтора на среду для каждой температуры (каждый с тремя техническими повторами).

Анализы роста на триптическом соевом кровяном агаре (TSBA) : Clip185 и Acidovorax sp. ⁹ наносили штрихами на планшеты TSBA, приобретенные у Carolina Biological (Берлингтон, Северная Каролина). Мы использовали гамма-гемолитический штамм Acidovorax в качестве контроля в этом эксперименте, поскольку он не гемолизирует эритроциты. Планшеты инкубировали при 37 ° C и визуализировали через 3 дня роста. Классификации гемолиза были присвоены в соответствии с информацией, изложенной в протоколе ASM. В эксперименте использовали три биологических повтора на штамм (каждый с тремя техническими повторами).

Анализы роста на маннитоловом солевом агаре (MSA) : чашки MSA, приобретенные в Carolina Biological (Берлингтон, Северная Каролина). Clip185 и Staphylococcus aureus (ферментер маннита, который продуцирует кислоту, используемый здесь в качестве положительного контроля) наносили штрихами на планшеты MSA, и планшеты инкубировали при 22 ° C. Планшет Clip185 MSA был визуализирован через 3-6 дней роста. Через 3 дня выращивания была сделана фотография планшета S. aureus . В эксперименте использовали три биологических повтора на штамм (каждый с тремя техническими повторами).

Анализы роста на среде T рис-фосфат (TP) -фенол красный сахар-агар: TP — среда TAP без ацетата (https://doi.org/10.17504/protocols.io.bgzujx6w). ⁹ Clip185 наносили штрихами на ТР-феноловую красную агаровую среду (pH 7,2), содержащую три разных сахара, как указано в разделе результатов, и планшеты инкубировали при 22 ° C. Чашки с культурами были визуализированы после 7 дней роста. Результаты интерпретировали, как описано в Mitra et al. , 2020. ⁹ В эксперименте использовали три биологических повтора на питательную среду (каждый с тремя техническими повторами).

Сравнительные анализы роста на картофельном агаре с декстрозой (PDA) и агаре Мюллера-Хинтона (MHA) : Clip185 наносили штрихами на чашки PDA и MHA и инкубировали при 30 ° C в течение трех дней. Планшеты были сфотографированы после трех дней роста. Планшеты PDA и MHA были приобретены у Carolina Biological (Берлингтон, Северная Каролина). В эксперименте использовали три биологических повтора на питательную среду (каждый с тремя техническими повторами).

Тестирование Световая регуляция продукции декапреноксантина: Clip185, Corynebacterium glutamicum штамм ATCC13032 и Kocuria rhizophila ATCC 9341 штамм наносили штрихами на две чашки со средой LB для каждого штамма. Для каждого штамма один планшет выдерживали при слабом освещении (20-25 мкмоль м ^-2 с ^-1 ), а другой держали в темноте при 22 ° C в течение пяти дней. Чашки с культурами были визуализированы через 5 дней роста. В эксперименте использовали три биологических повтора на штамм для каждого условия освещения (каждый с тремя техническими повторами).

Анализы роста на среде LB, содержащей тяжелые металлы : Приготовили среду LB, содержащую следующие концентрации солей металлов: а) 0,5 мМ, 1 мМ и 2 мМ хлорида кадмия; б) 0,5 мМ и 1 мМ хлорида кобальта (Co ²⁺ ); c) 0,5 мМ, 1 мМ и 2 мМ гептагидрат сульфата цинка; г) 0,5 мМ и 1 мМ пентагидрата сульфата меди; д) 1 мМ, 2 мМ и 4 мМ бромида никеля (Ni ²⁺ ) и; е) 2 мМ, 4 мМ, 6 мМ и 10 мМ хрома (Cr ⁶⁺ ) стандартный раствор.Хлорид кобальта и соли хлорида кадмия были приобретены у Strem Chemicals (Ньюберипорт, Массачусетс). Соль бромида никеля была приобретена у Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Соль пентагидрата сульфата меди и стандартный раствор хрома (Cr ⁶⁺ ) были приобретены у Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Стерильным деревянным аппликатором слегка постукивали по наросту Clip185 на планшете с LB-агаром Clip185 возрастом 2-3 дня, чтобы собрать примерно одинаковое количество клеток для каждого эксперимента.Этот деревянный аппликатор использовался для нанесения штрихов ячеек на соответствующие металлические пластины LB. Металлические пластины LB были визуализированы после определенного периода роста, отмеченного на рисунках и также указанного в подписях к рисункам (рисунки 14-19). В качестве контроля Clip185 наносили штрихами на планшет LB, и планшет отображали через 8 дней и 28 дней роста. Все планшеты инкубировали при интенсивности света 15-20 мкмоль ^-2 с ^-1 . В этом эксперименте использовали три биологических повтора для каждой концентрации металла.Каждая биологическая реплика имела три технических реплики.

Окрашивание по Граму, тест на оксидазу и тест на гидролиз крахмала

Окрашивание по Граму : Окрашивание по Граму Clip185 проводили с использованием коммерческих реагентов для окрашивания по Граму (VWR, Radnor, PA). Окрашенные по Граму клетки Clip185 отображали под масляной иммерсионной линзой с использованием камеры Samsung Galaxy S5 и адаптера сотового телефона для окуляра микроскопа. В эксперименте использовали три биологических повтора (каждый с тремя техническими повторами).

Тест на цитохром с оксидазу: Тест на оксидазу выполняли, как описано в Mitra et al. , 2020 ^8,9 с использованием одноразовых слайдов Difco DrySlide Oxidase, приобретенных в Carolina Biological (Берлингтон, Северная Каролина). Sphingobium yanoikuyae использовали в качестве оксидазо-положительного контроля в этом эксперименте. В эксперименте использовали три биологических повтора на штамм (каждый с тремя техническими повторами).

Тест гидролиза крахмала : Тест гидролиза крахмала проводили, как описано в Mitra et al., 2020 ^8,9 с использованием коммерческих чашек со средой Мюллера-Хинтона (MHA) (Carolina Biological, Burlington, NC). Clip185 и Bacillus subtilis наносили штрихами на чашки со средой MHA и инкубировали в течение 3 дней при 30 ° C. Через 3 дня роста были проведены тесты на гидролиз крахмала. Планшеты MHA были визуализированы до и после испытаний гидролиза крахмала. В эксперименте использовали три биологических повтора на штамм (каждый с тремя техническими повторами).

Экстракции декапреноксантина и спектрофотометрические анализы

Актинобактерии, подобные Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 и Kocuria rhizophila ATCC 9341, являются известными продуцентами каротиноидного декапреноксантина C ₅₀ .Следовательно, мы выбрали эти два бактериальных штамма в качестве контроля для эксперимента по спектрофотометрическому анализу декапреноксантина. Clip185, C. glutamicum и K. rhizophila Штаммы выращивали при интенсивности света 15-20 мкмоль м ^-2 с ^-1 . Клетки этих трех штаммов обрабатывали 5 мл 100% метанола для экстракции каротиноидов. Экстракцию пигмента проводили в темноте в течение 6 часов при 22 ° C. Экстрагированные пигменты обрабатывали, как описано в Mitra et al., 2020. ⁸ Спектрофотометрический анализ экстрагированных пигментов с помощью сканирования по длине волны (400–600 нм) проводили с использованием спектрофотометра Beckman Coulter DU 730 Life science UV / Vis (Brea, CA). Три максимальных пика поглощения декапреноксантина отслеживали при 413 нм, 437 нм и 467 нм, как описано для декапреноксантина и его глюкозидов в литературе. ^{30 — 32} C. glutamicum и K. rhizophila использовали в качестве положительных контролей в спектрофотометрических анализах.В этом эксперименте использовали три биологические повторы на штамм. Каждая биологическая реплика имела три внутренних повтора.

Выделение геномной ДНК Clip185 и ПЦР-амплификация частичного гена 16S рРНК

Выделение геномной ДНК Clip185 и проверка концентрации ДНК и чистоты выделенной геномной ДНК выполнялись, как описано в Mitra et al. , 2020. ^{8 , 9} Прямые и обратные последовательности праймеров 16S рРНК для ПЦР можно найти в Mitra et al., 2020 ^8,9 и в Klindworth et al. , 2013. ³³ ПЦР выполняли, как описано в Mitra et al. , 2020 ^8,9 со временем продления 1 минута.

Гель-экстракция ампликона 16S рРНК Clip185 и секвенирование ДНК

ПЦР-амплифицированный частичный геномный продукт 16S рРНК Clip185 (размер продукта приблизительно 445 п.н.) был очищен из агарозного геля и клонирован в векторе pCR4-TOPO TA, как описано в Mitra et al., 2020. ^{8 , 9} Один клон, содержащий частичный ген 16S рРНК Clip185, секвенировали в центре секвенирования ДНК Калифорнийского университета в Беркли. Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программ Chromas Lite (Technelysium) и BLAST.

Визуализация

Для визуализации всех культуральных пластин использовали камеру сотового телефона Samsung Galaxy S5. Обрезка и корректировка изображения производились с помощью приложения «Фото» в Windows 10 и Adobe Photoshop версии 22.3. Визуализацию и визуализацию гелей ДНК, окрашенных бромидом этидия, проводили с использованием Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR + (Bio-Rad, Hercules, CA).

Результаты

Выделение и очистка желто-пигментированного бактериального штамма

Мы выделили желто-пигментированную бактерию из загрязненной чашки со средой TAP штамма Chlamydomonas , штамм CLiP LMJ.RY0402.18514 (рисунок 1A). Мы очистили бактерию от зараженной культуральной чашки Chlamydomonas , используя метод штриховой пластинки. Мы выбрали двадцать одну отдельную колонию из чашки Clip185 с штрихами-LB и перенесли их на чашку со свежим агаром LB, используя пронумерованную сетку (базовые данные ³⁴ ).Колония № 37 была выбрана для дальнейших исследований (базовые данные ³⁴ ). Мы поддерживали запас колонии № 37 на агаре LB при 22 ° C и 15-25 мкмоль м ^-2 с ^-1 интенсивности света (рис. 1В). Мы назвали эту бактерию Clip185 в честь проекта библиотеки Chlamydomonas Library Project (CLiP) и первых трех цифр во второй части названия штамма Chlamydomonas CLiP LMJ.RY0402.185141, который она контаминировала. Мы депонировали штамм Clip185 в коллекцию культур ARS (номер доступа NRRL: B-65609).

Рис. 1. Выделение бактериального штамма Clip185 из зараженной чашки с ТАП-агаром

Chlamydomonas .

(A) Чашка со средой трис-ацетат-фосфат (ТАР) -агар, показывающая бактериальное заражение штамма Chlamydomonas при комнатной температуре (22 ° C). (B) Планшет со средой LB-агара очищенного штамма Clip185. Планшет для культивирования, показанный на (B), был визуализирован после 5 дней роста при 22 ° C и 20-25 мкмоль м ^-2 с ^-1 интенсивности света.

Тесты на чувствительность к антибиотикам Clip185

Мы контролировали относительную чувствительность к антибиотикам штаммов Clip185 и Chlamydomonas 4A + дикого типа, используя тесты диффузии диска KB, как описано в Mitra et al. 2020. ^{8 , 9} В наших экспериментах мы использовали два разных количества (50 мкг и 100 мкг) пенициллина, хлорамфеникола, неомицина, полимиксина B и ванкомицина. Средние диаметры зон задержки роста для каждого количества антибиотика с соответствующими стандартными отклонениями показаны в таблице 1. Для подробного статистического анализа данных трех биологических повторов (каждый из которых имел три внутренних повтора), пожалуйста, обратитесь к нашим базовым данным. ³⁵

Таблица 1.Средние диаметры зон задержки роста, полученные из тестов на чувствительность к антибиотикам с диффузной диффузией.

Зоны задержки роста в присутствии пяти различных антибиотиков (пенициллин, хлорамфеникол, неомицин, полимиксин B и ванкомицин) были изучены для Chlamydomonas reinhardtii и штамма бактерий Clip185. Серые и белые строки представляют 50 мкг и 100 мкг каждого антибиотика, нанесенного на диски из фильтровальной бумаги, соответственно. Три биологических повтора (каждый имел по три внутренних повтора) были использованы для расчета средних значений и стандартных отклонений, показанных в таблице.Статистический анализ доступен как базовые данные. ³⁵

12912mp9 Chlora12mp9 0 мм ± 0

Антибиотик	C. reinhardtii	Clip185 (Среднее ± стандартное отклонение)
Пенициллин	0 мм ± 01225 ±		0 мм 0 мм ± 0	0 мм ± 0
Полимиксин B	8,5 мм ± 0,2	0 мм ± 0
	9.6 мм ± 0,4	8,9 мм ± 0,1
Неомицин	9,5 мм ± 0,5	10,6 мм ± 0,1
	11,1 мм ± 0,1	14,8 мм ± 0,2
0 мм ± 0
	0 мм ± 0	0 мм ± 0
Ванкомицин	0 мм ± 0	44,5 мм ± 0,15
	мм ± 0	52.7 мм ± 0,15

Clip185 и Chlamydomonas были устойчивы к пенициллину и хлорамфениколу в обоих количествах (50 мкг и 100 мкг), поскольку не наблюдались зоны ингибирования роста (Таблица 1; основные данные ³⁵ ). Хламидомонада имела больший диаметр зоны ингибирования роста для 50 мкг полимиксина В (420,15 МЕ), чем Clip185 (таблица 1, основные данные ³⁵ ). И Chlamydomonas , и Clip185 имели больший диаметр зоны задержки роста для 100 мкг (840.3 МЕ) полимиксина B по сравнению с 50 мкг полимиксина B (таблица 1, основные данные ³⁵ ). P-значения из односторонних и двусторонних тестов гипотез на чувствительность к дозе 100 мкг полимиксина B составили 3% и 7% соответственно. Известно, что если диаметр зоны задержки роста более 12 мм при внесении 300 МЕ полимиксина B в тесте KB, то бактерия чувствительна к полимиксину B. ³⁶ Мы использовали количества полимиксина B, которые были в 1,4–2,8 раза выше, чем использованные для тестов KB, а зоны ингибирования роста Chlamydomonas и Clip185 были менее 12 мм (Таблица 1).Таким образом, исходя из диаметров зон ингибирования роста, как Chlamydomonas , так и Clip185 устойчивы к полимиксину B (таблица 1, основные данные ³⁵ ).

Chlamydomonas имел немного меньший диаметр зоны задержки роста для 50 мкг (38,75 МЕ) неомицина, чем Clip185 (таблица 1). Значение P из теста односторонней гипотезы было статистически значимым (3%), но значение P из теста двусторонней гипотезы не было статистически значимым для 50 мкг неомицина (Базовые данные ³⁵ ).Clip185 имел больший диметр зоны ингибирования роста для 100 мкг неомицина (77,5 МЕ), чем Chlamydomonas , и данные были статистически значимыми (таблица 1, базовые данные ³⁵ ). Известно, что если диаметр зоны задержки роста больше 16 мм, то бактерия чувствительна к 30 мкг неомицина в КБ-тесте. Мы использовали количества неомицина, которые были в 1,7–3,3 раза выше, чем те, которые используются для тестов KB (Таблица 1), а зоны ингибирования роста Chlamydomonas и Clip185 были менее 16 мм.Следовательно, как Chlamydomonas , так и Clip185 устойчивы к неомицину (таблица 1, основные данные ³⁵ ). Clip185 был высокочувствителен как к 50 мкг (50,35 МЕ), так и к 100 мкг (100,7 МЕ) ванкомицина, в то время как Chlamydomonas был устойчив к ванкомицину, поскольку не обнаруживал никаких зон ингибирования роста (таблица 1, основные данные ³⁵ ). Таким образом, результаты нашего КБ-теста показывают, что ванкомицин является лучшим препаратом для минимизации загрязнения Clip185 на ТАР-агаре.

Затем мы нанесли штрихами Chlamydomonas и бактерию Clip185 на чашки с агаром TAP, содержащим 50 мкг ванкомицина на мл среды TAP, и инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение 2 дней.5 недель (рисунок 2). Clip185 не рос на планшете TAP, содержащем 50 мкг / мл ванкомицина, в отличие от Chlamydomonas (рис. 2) через 2,5 недели. Следовательно, ванкомицин в концентрации 50 мкг / мл в среде TAP является бактерицидным по отношению к Clip185 на культуральных планшетах Chlamydomonas , не препятствуя росту водорослей.

Рис. 2. Тестирование эффективности ванкомицина в устранении загрязнения Clip185.

Штаммы Chlamydomonas дикого типа 4A + и Clip185 наносили штрихами на чашку с ТАП-агаром, содержащую 50 мкг ванкомицина / мл среды.Планшет с антибиотиком с ТАР-агаром инкубировали при комнатной температуре (22 ° C) в течение 2,5 недель перед визуализацией.

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму показало, что Clip185 является грамположительной малой палочкой. Клетки представляли собой небольшие стержни, и часто два стержня были соединены друг с другом (рис. 3).

Рис. 3. Clip185, окрашенный по Граму, при 100-кратном увеличении.

Клетки Clip185 из трехдневного культурального планшета с LB-агаровой средой использовали для окрашивания по Граму. Окрашенные по Граму клетки визуализировали под масляной иммерсионной линзой светлопольного микроскопа и отображали с помощью камеры смартфона.

Анализ роста Clip185 на чашках с агаровой средой TAP и LB при различных температурах

Clip185 хорошо рос на LB при 22 ° C, а также при 37 ° C на LB-агаре (рис. 4A-B). Он медленно рос на ТАП-агаре при 22 ° C и 37 ° C (рис. 4C-D), как видно из сравнения 3-дневного роста на чашках LB и 7-дневного роста на чашках TAP. Следовательно, Clip185 — мезофил.

Рис. 4. Рост Clip185 на агаровой среде с TAP и LB при разных температурах.

(A) Рост на чашке со средой LB-агар при комнатной температуре (22 ° C).(B) Рост на чашке со средой LB-агара при 37 ° C. (C) Рост на чашке со средой TAP-агар при 22 ° C. (D) Рост на чашке со средой с ТАП-агаром при 37 ° C. Планшеты с LB-агаром были визуализированы через 3 дня роста. Чашки с ТАП-агаром для культивирования визуализировали через 7 дней роста.

Тестирование способности Clip185 лизировать эритроциты

Clip185 мог частично лизировать эритроциты при выращивании на чашках с трипсиновым соевым агаром в течение трех дней при 30 ° C, что видно по зеленоватому обесцвечиванию вокруг нароста Clip185 (рис. 5A) .

Рис. 5. Clip185 является гамма-гемолитическим.

(A) 72-часовой рост Clip185 на чашке с триптическим соевым агаром с кровью. (B) 72-часовой рост гамма-гемолитика Acidovorax sp. на чашке с триптическим соевым агаром с кровью. Планшеты со средой инкубировали при 37 ° C.

Мы использовали гамма-гемолитический штамм Acidovorax в качестве контроля в этом эксперименте (рис. 5B), который не может гемолизировать эритроциты. Как и ожидалось, не было никаких следов гемолиза вокруг роста Acidovorax ⁹ на чашке с триптическим соевым агаром (рис. 5В).

Тестирование на наличие / отсутствие цитохром-с-оксидазы в Clip185

Мы провели оксидазный тест на Clip185 и грамотрицательной бактерии Sphingobium yanoikuyae. Наши результаты теста на оксидазу показали, что S. yanoikuyae является оксидазо-положительным (рис. 6; слева), а Clip185 — отрицательным по оксидазе (рис. 6; справа). Результаты интерпретировались так, как указано в разделе, посвященном методам данной статьи. ^{8 , 9} Следовательно, Clip185 не продуцирует цитохром с оксидазу, фермент, участвующий в цепи переноса электронов в дыхании бактерий.

Рис. 6. Clip185 отрицательный по оксидазе.

Клетки Sphingobium yanoikuyae (слева) и Clip185 (справа) нанесены штрихами на одноразовое предметное стекло, содержащее пленку, покрытую оксидазным реагентом дигидрохлоридом тетраметил-п-фенилендиамина (TMPD). Изображение слайда было получено через 10 секунд после нанесения клеток на слайд.

Проверка способности Clip185 использовать различные сахара в качестве источников углерода и ферментировать их

Мы не хотели использовать среду LB для проверки способности Clip185 использовать другие сахара в качестве источника углерода, потому что в богатой питательными веществами LB среда превращается в глюкозу посредством глюконеогенеза.Агаровая среда TP представляет собой среду TAP без ацетата. Следовательно, в среде TP отсутствует источник углерода. ^{8 , 9} Мы добавили в среду TP (pH 7,2) отдельно три разных сахара (глюкоза, сахароза и лактоза) и индикатор pH, феноловый красный. (Рисунок 7). Мы выращивали Clip185 на этих нейтральных сахарных пластинах TP +. Фиг. 7A, C и E представляют контрольные чашки TP + 1% глюкозы, TP + 1% сахарозы и TP + 1% лактозы (без Clip185) соответственно. Эти контрольные планшеты показывают светлый красноватый цвет фенолового красного при pH 7.2. Clip185 рос на чашках TP + 1% глюкозы и TP + 1% сахарозы и ферментировал соответствующие сахара (фигура 7B; фигура 7D), но не рос на чашке TP + 1% лактозы (фигура 7F). Ферментация глюкозы и сахарозы дает кислоты, которые снижают pH в среде TP. При снижении pH светло-красный цвет фенолового красного изменился на желтый (Рисунок 7B; Рисунок 7D).

Фиг. 7. Рост Clip185 на трис-фосфатной (TP) агаровой среде с добавлением различных сахаров.

(A) Планшет с контрольной TP + 1% агаровой средой с глюкозой и феноловым красным в качестве индикатора pH.(B) Clip185 на планшете с агаровой средой TP + 1% с феноловым красным в качестве индикатора pH. (C) Контрольная чашка TP + 1% сахарозный агар с феноловым красным в качестве индикатора pH. (D) Рост Clip185 на чашке с агаровой средой TP + 1% с феноловым красным в качестве индикатора pH. (E) Контрольный планшет TP + 1% агар с лактозным агаром с феноловым красным в качестве индикатора pH. (F) Рост Clip185 на чашке с агаровой средой TP + 1% с феноловым красным в качестве индикатора pH. Чашки с культурами были визуализированы после 7 дней роста при комнатной температуре.

Способность Clip185 расти на маннитоловом солевом агаре (MSA) и ферментировать маннит.

Clip185 рос на MSA (фиг. 8A-B) и ферментированном манните в MSA до медленной кислоты по сравнению с быстрой ферментацией маннита, проявляемой грамположительными бактериями. Золотистый стафилококк (Рисунок 8C). Производство кислоты снизило pH MSA. При снижении pH светло-красный цвет фенолового красного изменился на желтый (рис. 8).

Фиг. 8. Рост Clip185 на среде с маннитоловым солевым агаром (MSA).

(A) 3-дневный рост Clip185 на планшете с MSA. (B) 6-дневный рост Clip185 на планшете MSA . (C) 3-дневный рост Staphylococcus aureus на пластине MSA. Планшеты со средой инкубировали при 30 ° C.

Тест гидролиза крахмала

Крахмал имеет две формы: линейную амилозу и разветвленный амилопектин.Большой размер амилозы и амилопектина предотвращает перенос этих химических веществ через стенку бактериальной клетки. Бактерии выделяют ферменты α-амилазу и олиго-1,6-глюкозидазу для разложения крахмала. Эти ферменты разлагают внеклеточный крахмал до глюкозы / декстрана, которые могут использоваться бактериями в качестве источников углерода. Тест гидролиза крахмала используется для идентификации бактерий, которые могут использовать внеклеточный крахмал в качестве источника углерода / энергии. Традиционно картофельный агар с декстрозой (КПК) используется для тестов на гидролиз крахмала.Clip185 плохо рос на КПК (базовые данные ³⁷ ). Он хорошо рос на агаре Мюллера-Хинтона (MHA), который представляет собой богатую среду, используемую для выращивания бактерий, которые имеют особые потребности в питании (привередливые бактерии) (основные данные ³⁷ ). Поэтому мы выбрали ГАМ, который содержит 0,15% крахмала, чтобы проверить способность Clip185 гидролизовать крахмал.

Мы использовали Bacillus subtilis, , который, как известно, гидролизует крахмал, в качестве положительного контроля в эксперименте. Мы вырастили как Clip185, так и B.subtilis на MHA в течение 3 дней и визуализировали планшеты (Рисунок 9A; Рисунок 9C). Затем в чашки Clip185 и B. subtilis добавляли грамм йода. Йод прореагировал с крахмалом в ГАМ с образованием светло-голубого цвета. Оба Clip185 (фиг. 9B) и B. subtilis (фиг. 9D) дали положительный результат в тесте на гидролиз крахмала, поскольку есть видимая прозрачная зона, обозначенная черными стрелками, окружающая рост каждого из этих двух штаммов на MHA из-за гидролиз крахмала.

Рис. 9. Clip185 может гидролизовать крахмал.

(A) 3 дня — рост Clip185 при 30 ° C на среде Мюллера-Хинтона, содержащей 0,15% крахмала. (B) Пластина Мюллера-Хинтона Clip185, показанная на (A), была обработана грамм-йодом. (C) 3 дня роста Bacillus subtilis при 30 ° C на среде Мюллера-Хинтона, содержащей 0,15% крахмала. (D) B. subtilis Пластина Мюллера-Хинтона, показанная на (C), обработанная грамм-йодом. Черные стрелки указывают на прозрачные зоны гидролиза крахмала вокруг роста бактерий.

Частичное секвенирование гена 16S рРНК Clip185

Ген 16S рРНК имеет девять гипервариабельных (V1-V9) и девять консервативных областей (C1-C9). ^{38 — 40} Мы использовали ген 16S рРНК Escherichia coli длиной 1541 п.н. (фиг. 10A) в качестве ссылки в схемах гена 16S рРНК на фиг.10. Всего 11 нуклеотидов (788- 798), расположенные в консервативной области C4, полностью консервативны у бактерий. ⁴¹ Суперконсервативная область размером 11 п.н. представлена ​​черным ящиком внутри области C4 на схемах (рис. 10).Прямой и обратный праймеры для ПЦР, специфичные для гена 16S рРНК, представлены черными стрелками на схеме гена 16S рРНК (фиг. 10A). Ампликон размером 445 п.н. был получен после амплификации с помощью ПЦР частичного гена 16S рРНК Clip185 (лежащие в основе данные ⁴² ). Этот ампликон размером 445 п.н. был клонирован. Затем клон, несущий ампликон Clip185, секвенировали для определения таксономической идентичности Clip185.

Фигура 10. ПЦР-амплификация частичного гена 16S рРНК в анализах Clip185 и NCBI-BLAST.

(A) Схематическая диаграмма, показывающая девять консервативных и гипервариабельных областей в гене 16S рРНК. Чередующиеся консервативные области (C1 – C9) показаны темно-серым цветом, а гипервариабельные области (V1 – V9) изображены белым. Черный ящик в области C4 представляет 11 нуклеотидов (788-798 пар оснований), которые инвариантны для бактерий. ^{8 , 9} Толстые черные стрелки обозначают специфичные для гена 16S рРНК прямые и обратные праймеры ПЦР в области C2 и области C4, соответственно.Генная диаграмма основана на последовательности гена 16S рРНК E. coli. См. Также Базовые данные. ⁴² (B) Схематическая диаграмма, показывающая нуклеотидные изменения в Clip185 в области 16S рРНК, охватывающей области C2 и C4, по сравнению с лучшим результатом NCBI-BLAST в 2019 году (оценка 800; значение E 0 и процент идентичности 99,10%): Microbacterium binotii штамм PK1-12M 16S ген рибосомной РНК, частичная последовательность (номер доступа в GenBank: MN428150.1). (C) Схематическая диаграмма, показывающая нуклеотидные изменения в Clip185 в области 16S рРНК, охватывающей области C2 и C4, по сравнению с лучшим результатом NCBI-BLAST в 2021 году (оценка 806; значение E 0 и процент идентичности 99.33%): Microbacterium sp. Штамм MDP6, ген рибосомной РНК 16S, частичная последовательность (номер доступа в GenBank: MK128451.1). Черные нуклеотиды показывают нативные нуклеотиды в BLAST hits Microbacterium binotii, штамм PK1-12M и Microbacterium sp. MDP6, которые были заменены изображенными красными нуклеотидами в последовательности гена 16S рРНК Clip185. Черные жирные числа в скобках рядом с нуклеотидами показывают конкретные положения нуклеотидов, в которых произошли нуклеотидные изменения.Положения нуклеотидов, показанные на фигурах, присвоены в соответствии с положением гена 16S рРНК E. coli.

В 2019 году анализ NCBI-нуклеотидов BLAST выявил штамм PK1-12M Microbacterium binotii (номер доступа в GenBank: MN428150.1) как наиболее близкий к Clip185 на основе частичной последовательности гена рибосомной РНК 16S с оценкой 800 , значение E, равное 0, и процент идентичности 99,10%. Четыре нуклеотидные замены были идентифицированы в частичной последовательности гена 16S рРНК Clip185 относительно таковой в штамме PK1-12M Microbacterium binotii (фиг. 10B).В области C4 были обнаружены один переход и одна трансверсия (Рисунок 10B). Мы обнаружили один переход в области C2 и одну трансверсию в сверхконсервативной суб-области длиной 11 п.н. в области C4 (рис. 10B). Мы депонировали эту частичную последовательность гена 16S рРНК Clip185 в NCBI GenBank с описанием: Microbacterium binotii штамм PK1-12M вариант гена 16S рибосомной РНК, частичная последовательность (номер доступа: MN633284.1). В начале 2021 года анализ BLAST обнаружил новое совпадение: Microbacterium sp. штамм MDP6 (номер доступа: MK128451.1) с оценкой 806, значением E 0 и процентной идентичностью 99,33%) (последний доступ NCBI 8-26-21, фиг. 10C). Мы обнаружили три нуклеотидных изменения в гене 16S рРНК Clip185 относительно этого нового попадания: один переход в области C2, одну трансверсию в суперконсервативной суб-области 11 п.н. в области C4 и одну делецию в области C4 (рис. 10С). Анализ доступных последовательностей генома Microbacterium sp. на NCBI выявили, что последовательности полного генома для штаммов Microbacterium binotii PK1-12M и Microbacterium sp. штамм MDP6 недоступен (данные NCBI последний раз просматривались 8-26-2021).

Спектрофотометрический анализ пигментов, синтезированных Clip185

Каротиноиды синтезируются из предшественника изопентенилпирофосфата и его изомера диметилаллилпирофосфата в пути биосинтеза терпеноидов ¹⁶ (рис. 11). Две молекулы геранилгеранилдифосфата конденсируются с образованием фитоена (рис. 11). Ликопин (красный каротиноид C ₄₀ ) образуется в результате четырехступенчатой ​​ферментативной десатурации фитоена (рис. 11).Ликопин дипренилируется и гидроксилируется с образованием C ₅₀ каротиноидов ^{16 , 17} (Фиг.11). На сегодняшний день в литературе известны три различных пути биосинтеза каротиноидов C ₅₀ : 1) ε-циклический путь биосинтеза декапреноксантина каротиноидов C ₅₀ в Corynebacterium glutamicum ; ^16,43,44 2) β-циклический C ₅₀ каротиноидный путь биосинтеза C.p.450 в Dietzia sp. CQ4 ⁴⁵ и; 3) путь биосинтеза γ-циклического каротиноида С50 сарцинаксантина в Micrococcus luteus NCTC2665. ¹⁸ Microbacterium принадлежит к грамположительному отряду Actinomycetales. Многие представители Actinomycetales продуцируют каротиноид C ₅₀ , декапреноксантин. ¹⁶

Рис. 11. Схематическое изображение путей биосинтеза C

₅₀ у бактерий.

C ₄₀ каротиноид ликопин дипренилируется с образованием ациклического C ₅₀ каротиноида, флавуксантина. Флавуксантин подвергается циклизации тремя различными способами с образованием трех типов природных каротиноидов C ₅₀ в бактериях.Названия субстратов и промежуточных продуктов сокращены и показаны черным цветом. Гены, кодирующие ферменты, катализирующие определенные реакции / этапы путей, показаны синим цветом. Сокращения: IPP, изопентенилпирофосфат; ДМФП, диметилаллилпирофосфат; GPP, геранилпирофосфат; FPP, фаренсилпирофосфат; GGPP, геранилгеранилпирофосфат; C.p. 496, 2,2′-Бис- (3-метилбут-2-енил) -3,4,3 ‘, 4′-тетрадегидро-1,2,1′, 2′-тетрагидро-ψ, ψ-каротин-1 , 1-диол; C.p.450, 2,2’-бис- (4-гидрокси-3-метилбут-2-енил) -β, β-каротин.Цифры в верхнем индексе: 1 обозначает lbtC в слитом гене lbtBC; 2 обозначает lbtA и lbtB в слитом гене lbtBC; 3 обозначает Micrococcus luteus , ген ; 4 обозначает гена Corynebacterium glutamicum , а 5 обозначает Dietzia sp. Гены CQ4 .

Поскольку наше частичное секвенирование гена 16S рРНК показало, что Clip185 представляет собой Microbacterium sp. мы извлекли желтый пигмент из Clip185 (Рисунок 12A; Рисунок 12C) и выполнили спектрофотометрический анализ, чтобы определить, производит ли Clip185 декапреноксантин (Рисунок 12).Поскольку актинобактерии C. glutamicum и Kocuria rhizophila , как известно, продуцируют декапреноксантин, ^{16 , 30} мы использовали пигменты, экстрагированные из этих двух бактериальных штаммов (Рисунок 12A; Рисунок 12C) в качестве положительного контроля в спектрофотометрических анализах. (Рисунок 12).

Рис. 12. Спектрофотометрический анализ экстрагированных пигментов Clip185.

(A) Пробирки Falcon, содержащие экстрагированные метанолом пигменты Corynebacterium glutamicum (X) и Clip185 (Y).(B) Спектры поглощения экстрагированных пигментов C. glutamicum (X, темно-синий спектр) и Clip185 (Y, бледно-синий спектр). (C) Пробирки Falcon, содержащие экстрагированные метанолом пигменты Kocuria rhizophila (Z) и Clip185 (Y). (D) Спектры поглощения экстрагированных пигментов K. rhizophila (Z, темно-синий спектр) и Clip185 (Y, бледно-синий спектр). Отмечены три основных пика абсорбции декапреноксантина.

Мы обнаружили, что C. glutamicum (спектр X на рисунке 12B) и K.Спектры поглощения пигментов rhizophila (Z-спектр на Фигуре 12D) показали три основных пика поглощения, которые представляют поглощение декапреноксантина при 413 нм, 437 нм и 467 нм, как описано в литературе. ^{30 — 32} Эти три пика поглощения из спектра поглощения C. glutamicum X и K. rhizophila спектр поглощения Z очень красиво наложены на три пика поглощения из спектра поглощения Clip185 (спектр Y на рисунке 12B и рисунок 12D).Этот результат убедительно свидетельствует о наличии декапреноксантина в Clip185. Анализы ВЭЖХ и / или ЖХ / МС могут подтвердить присутствие декапреноксантина в Clip185. Однако у нас нет доступа к таким аналитическим инструментам в нашем учреждении.

Светорегуляция продукции декапреноксантина в Clip185

Известно, что у нефототрофных бактерий биосинтез каротиноидов C ₅₀ может модулироваться условиями роста (например, наличием / отсутствием света). ^{15 , 46 , 47} Мы изучили продукцию декапреноксантина в Clip185, C.glutamicum и K. rhizophila при слабом освещении (20-25 мкмоль м ^-2 с ^-1 ). В темноте Clip185 приобретает кремовый цвет со светло-желтоватым оттенком (рис. 13А, слева). Производство декапреноксантина в Clip185 индуцировалось под действием света (рис. 13А, справа). Продукция декапреноксантина сильно индуцируется под светом у C. glutamicum , как указано в опубликованной литературе ¹⁹ , в отличие от таковой в Clip185 (фиг. 13A; фиг. 13B). К.rhizophila постоянно продуцирует декапреноксантин независимо от условий освещения (фиг. 13C).

Рис. 13. Производство декапреноксантина в светлом и темном на среде LB.

(A) Производство декапреноксантина в Clip185 в темноте и на свету. (B) Производство декапреноксантина в C. glutamicum в темноте и на свету. (C) Продукция декапреноксантина в K. rhizophila в темноте и на свету. Планшеты с бактериальной культурой выставляли в темноте или на свету в течение 5 дней при 22 ° C, а затем визуализировали.Интенсивность света составляла 20-25 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Рост Clip185 на среде LB, содержащей токсичные концентрации тяжелых металлов

Так как Microbacterium sp. был изолирован из окружающей среды, загрязненной тяжелыми металлами, ¹⁵ мы решили проверить, может ли Clip185 выдерживать токсичные концентрации (от 0,5 до 6 мМ) шести различных тяжелых металлов: кадмия, кобальта (Co ²⁺ ), цинк, медь (Cu ²⁺ ), никель (Ni ²⁺ ) и хром [Cr ⁶⁺ ] (Фигуры 14-19).Clip185 может хорошо расти с желтой пигментацией на 0,5 мМ кадмиевой пластине (рис. 14A), но растет медленно на 1-мМ кадмиевой пластине и сохраняет продукцию пигмента (рис. 14B). Clip185 медленно растет на пластине 2 мМ кадмия, но со временем перестает расти и приобретает белый цвет (Рисунок 14C; Рисунок 14D). Рост Clip185 в течение 8 дней и 28 дней на пластине LB показан для сравнения (фигура 14E). Clip185 хорошо рос с желтой пигментацией на пластине с 0,5 мМ кобальта (Фигура 15A), но не рос на пластине с 1 мМ кобальта (Фигура 15B).Clip185 хорошо рос с желтой пигментацией на цинковых пластинах 0,5 мМ и 1 мМ (фиг. 16A-B), но рос очень медленно на 2 мМ цинковых пластинах (фиг. 16C). Clip185 хорошо рос с желтой пигментацией на 0,5 мМ медной пластине (фиг. 17A), но не рос на 1 мМ медной пластине (фиг. 17B). Clip185 хорошо рос с желтой пигментацией на никелевых пластинах 1 мМ и 2 мМ (Фигура 18A-B), но не рос на пластинах с никелем 4 мМ (Фигура 18C). Clip185 мог хорошо расти с желтой пигментацией на пластине из хрома 2 мМ и 4 мМ (фиг. 19A-D), но рос очень медленно с желтой пигментацией на пластине из 6 мМ хрома (фиг. 19E-H).Clip185 не смог расти на 10 мМ хромовой пластине после 90 дней инкубации (основные данные ⁴⁸ ).

Рис. 14. Рост Clip185 на среде LB, содержащей кадмий.

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 0,5 мМ кадмия. (B) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB, содержащей 1 мМ кадмия. (C) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ кадмия. (D) 45-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ кадмия. (E) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB (контроль).На рисунках указано количество дней роста. Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Рисунок 15. Рост Clip185 на среде LB, содержащей кобальт.

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 0,5 мМ кобальта. (B) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB, содержащей 1 мМ кобальта. На рисунках указано количество дней роста. Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Рисунок 16.Рост Clip185 на среде LB, содержащей цинк.

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 0,5 мМ цинка. (B) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 1 мМ цинка. (C) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ цинка. На рисунках указано количество дней роста. Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 . Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Рис. 17. Рост Clip185 на среде LB, содержащей медь.

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 0,5 мМ меди. (B) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB, содержащей 1 мМ меди. На рисунках указано количество дней роста. Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Рис. 18. Рост Clip185 на среде LB, содержащей никель.

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 1 мМ никель. (B) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ никеля.(C) 8 дней (слева) и 28 дней (справа) — рост Clip185 на среде LB, содержащей 4 мМ никеля. На рисунках указано количество дней роста. Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 .

Фиг. 19. Рост Clip185 на среде LB, содержащей шестивалентный хром (Cr

⁶⁺ ).

(A) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ Cr ⁶⁺ . (B) 28-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 2 мМ Cr ⁶⁺ .(C) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 4 мМ Cr ⁶⁺ . (D) 28-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 4 мМ Cr ⁶⁺ . (E) 8-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 6 мМ Cr ⁶⁺ . (F) 28-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 6 мМ Cr ⁶⁺ . (G) 67-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 6 мМ Cr ⁶⁺ . (H) 90-дневный рост Clip185 на среде LB, содержащей 6 мМ Cr ⁶⁺ . На рисунках указано количество дней роста.Интенсивность света составляла 10-15 мкмоль м ^-2 с ^-1 . См. Также Базовые данные. ⁴⁸

Обсуждение

Наши биохимические и физиологические анализы Clip185 и его частичное секвенирование гена 16S рРНК показали, что Clip185 принадлежит к таксону Microbacterium . Microbacterium принадлежит к классу актинобактерий. Актинобактерии — это в основном аэробные грамположительные бактерии с высоким содержанием G + C и поперечными связями B-типа в пептидогликане. ^{49 , 50} 124 вида Microbacterium были идентифицированы с официально опубликованным названием в Списке названий прокариот, стоящих в номенклатуре [LPSN] (последний доступ 8-26-21). Microbacterium вида были выделены из различных сред и хозяев. ^{14 , 15 , 49 , 51 — 53} Мы изолировали Clip185 от загрязненной средней чашки TAP с температурой C.reinhardtii , но он неожиданно плохо рос на агаре TAP (не обогащенном аминокислотами / пептидами), как он рос на агаре LB, обогащенном пептидами, аминокислотами и витаминами (рисунок 1; рисунок 4). Он также плохо рос на КПК (не обогащенном аминокислотами / пептидами), в то время как он хорошо рос на МГА, который содержит экстракт говядины и кислотный гидролизат казеина в качестве богатого источника аминокислот (базовые данные ³⁷ ). Эти результаты, взятые вместе, показывают, что Clip185 имеет высокие потребности в аминокислотах / пептидах / витаминах для роста и является привередливой бактерией.

Clip185 был устойчив к пенициллину, хлорамфениколу, неомицину и полимиксину B, но был очень чувствителен к разрушающему клеточную стенку антибиотику ванкомицину (таблица 1, основные данные; ³⁵ рисунок 2). Тринадцать изолятов Microbacterium из загрязненной металлами почвы в Сеймуре, штат Индиана (США), были устойчивы к хлорамфениколу, ампициллину и ванкомицину. ²⁷ Напротив, M. yannicii PS01, штамм с множественной лекарственной устойчивостью, выделенный от пациента с муковисцидозом, был чувствителен к хлорамфениколу, амоксициллину, ванкомицину и колистину (полимиксин E), но устойчив к тобрамицину ⁴⁹ (аминогликозидный антибиотик). как неомицин, который связывается с 30S субъединицей прокариотической рибосомы).

Вызывающие бактериемию Microbacterium sp. были выделены из клинических образцов, таких как катетер, кровь и т. Д. ^{54 — 56} Частичный ген 16S рРНК Clip185 имеет 99,1% идентичность последовательности с последовательностью штамма M. binotii PK1-12M, геном которого не обнаружен. секвенированы еще (рис. 10В). Сообщалось о случае бактериемии, вызванной M. binotii , у пациента с серповидно-клеточной анемией. ⁵⁶ Штаммы M. binotii CIP 101303T и CIP 102116 из Коллекции Института Пастера были выделены из крови человека в 1976 и 1977 годах соответственно. ⁵⁷ Поскольку Clip185 устойчив к четырем основным антибиотикам, он может стать условно-патогенным микроорганизмом человека, как ранее сообщалось для других видов Microbacterium , особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом.

В литературе существует несколько экологических изолятов Microbacterium , устойчивых к тяжелым металлам. ^{15 , 20 — 26} Один из двух ближайших родственников Clip185, M.binotii , штамм PK1-12M, был выделен из первичной лесной почвы торфяных болот в провинции Сураттани в Таиланде (номер доступа: MN428150.1). Известно, что торфяные почвы обогащены тяжелыми металлами, особенно на верховых болотах, расположенных вблизи мест добычи и выплавки металлов. ⁵⁸ Низменные тропические леса и мангровые леса с соленой водой обычно окружают торфяные болотные леса недалеко от побережья. ⁵⁹ Четыре штамма-продуцента биоэмульгатора Microbacterium были выделены из загрязненных нефтью отложений мангровых зарослей в заливе Гуанабара (Рио-де-Жанейро, Бразилия).Эти штаммы были способны удалять кадмий и цинк с загрязненных промышленных территорий с различной способностью в зависимости от используемых источников углерода. ⁵⁹ В 2021 году анализ BLAST выявил Microbacterium sp. штамм MDP6 как ближайший родственник Clip185 (номер доступа: MK128451.1). Microbacterium sp. Штамм MDP6 представляет собой устойчивые к цинку и кадмию эндофитные бактерии, выделенные в Таиланде из Murdannia Spectabilis (Kurz) Faden. со свойствами, стимулирующими рост растений. ⁶⁰

Насколько нам известно, мы не смогли найти в литературе сообщений о минимальных концентрациях различных тяжелых металлов, переносимых бактериями. Устойчивость к тяжелым металлам шестнадцати различных штаммов Microbacterium sp. выделенный из образцов почвы, загрязненных металлами, в Сеймуре, штат Индиана, США, был изучен исследовательской группой. ²⁷ 11 из 16 изолятов Microbacterium были способны выдерживать концентрации (0,1 мМ) кобальта, кадмия и никеля, в дополнение к 0.5–20 мМ Cr (VI) (0,5–20 мМ). Четыре из этих 16 изолятов Microbacterium показали отсутствие толерантности к кадмию. ²⁷ Clip 185 может переносить 2 мМ кадмия, цинка и никеля, 0,5 мМ кобальта и меди и 6 мМ Cr ⁶⁺ на LB-агаре (рисунки 14-19). Clip185 показал более высокую устойчивость к кадмию, никелю и цинку, но более низкую устойчивость к Cr ⁶⁺ , чем у выделенных штаммов 16 Microbacterium , указанных выше. ²⁷ Основываясь на толерантности Clip185 к тяжелым металлам, мы можем предположить, что он может процветать в экологических нишах, обогащенных тяжелыми металлами, в природе.Мы использовали LB в нашей лаборатории для выращивания Clip185. LB — это богатая питательными веществами среда, которая способствует росту большинства бактерий. У привередливых бактерий сложные пищевые потребности. Обзоры литературы показали, что исследователи обычно используют триптический соевый агар / бульон (TSA / B) для выращивания микробактерий . ^15,16 TSA / B представляет собой сложную питательную среду, которая имеет более высокую концентрацию аминокислот / пептидов и углеводов по сравнению с таковой в LB. Следовательно, возможно, что Clip185 имеет более высокую устойчивость к тяжелым металлам, которая не была полностью отображена при выращивании на среде LB, использованной в наших экспериментах.В будущем мы хотели бы более полно оценить устойчивость Clip185 к тяжелым металлам в TSA / B.

Внеклеточные барьеры тяжелых металлов, внеклеточная секвестрация металлов, активный отток ионов металлов, внутриклеточная секвестрация металлов и восстановление ионов металлов — вот некоторые из микробных защитных механизмов, используемых для борьбы со стрессом, вызванным тяжелыми металлами. ^{61 — 63} В будущем мы хотим спектрофотометрически контролировать рост Clip185 на длине волны 600 нм в TSB, содержащем тяжелые металлы, чтобы определить, способен ли Clip185 противостоять тяжелым металлам. ^{16 , 27} В окружающей среде Cr ⁶⁺ (растворимая высокотоксичная форма хрома) восстанавливается до Cr ³⁺ , нерастворимой, менее токсичной формы. ⁶⁴ Способность Clip185 восстанавливать Cr ⁶⁺ до Cr ³⁺ в TSB может быть протестирована с использованием спектрофотометрических анализов, как описано в Henson et al. , 2015. ¹⁶ Результаты этих экспериментов помогут нам окончательно определить способность Clip185 к мобилизации металлов и, возможно, его потенциальное использование в биоремедиации.

Каротиноиды — это пигменты желто-красного цвета, обнаруженные у всех фотосинтезирующих эукариот и прокариот, а также у нефотрофных микробов. ⁶⁵ Прокариотические каротиноиды демонстрируют различные химические структуры по сравнению с эукариотическими. ⁶⁶ Каротиноиды играют разнообразную биологическую роль (например, как антиоксиданты и светособирающие пигменты, светозащита, действуют как мембранные стабилизаторы или репрессоры трансляционного надзора и защитных путей у нематод и т. Д.). ^{30, 67 , 68} В коммерческих целях каротиноиды используются в качестве пищевых красителей, кормовых добавок для животных, косметики, антиоксидантов и других добавок для здоровья. ^{67 , 69} Пути биосинтеза каротиноидов и связанные с ними ферменты хорошо изучены (рис. 11).

C ₄₀ каротиноиды являются преобладающим классом каротиноидов. Каротиноиды C ₃₀ и C ₅₀ встречаются редко. ⁷⁰ На сегодняшний день каротиноиды C ₅₀ в основном выделены из нефототрофных бактерий, таких как галофильные архебактерии, Halobacteria и Halococcus , ^71,72 грамположительные Actinobacteria ¹⁸ и одна грамотрицательная бактерия. , Псевдомонады. ^16,73 C ₅₀ каротиноиды имеют множественные сопряженные двойные связи и полярные гидроксильные группы, что влияет на их антиоксидантные и светособирающие свойства. Эти химические свойства делают их привлекательными кандидатами для использования в фотозащитной косметике и солнцезащитных средствах. ^{16 , 18}

Секвенирование всего генома Microbacterium sp. штамм PAMC28756, выделенный из Stereocaulon sp. , антарктический лишайник, выявил наличие кластеров генов биосинтеза каротиноидов C ₅₀ . ⁷⁴ Недавно было показано, что кластеры генов биосинтеза каротиноидов C ₅₀ являются наиболее распространенными кластерами генов вторичных метаболитов у 70 штаммов Microbacterium , выделенных из загрязненных металлами и незагрязненных участков. ¹⁵ Мы показали, что Clip185 продуцирует декапреноксантин-подобные актинобактерии, C. glutamicum и K. rhizophila (фигура 12). У нефотрофных бактерий выработка каротиноидов в основном подразделяется на три типа: 1) индуцируемая светом, 2) конститутивная и 3) скрытая. ^{66 , 75} Большинство бактерий продуцируют каротиноиды конститутивно, но такие бактерии, как Myxococcus , Streptomyces , Mycobacterium , Agromyces и Sulfolobus , производят каротиноиды только на свету. Производство каротиноидов у двух видов Streptomyces , то есть Streptomyces setonii и Streptomyces griseus , обозначено как скрытое, поскольку условия роста, запускающие биосинтез каротиноидов у этих бактерий, на данный момент неизвестны. ^{66 , 75} Продукция каротиноидов слабо индуцируется в двух изолятах из окружающей среды Microbacterium , т.е. M. phyllosphaerae и M. foliorum , но сильно индуцируется в двух изолятах M. natoriense. ¹⁹

Мы показали, что Clip185 синтезирует декапреноксантин на свету, но индукция не такая сильная, как у C. glutamicum (рис. 13A-B). В 2019 году Sumi et al. ¹⁹ показали, что свет сильно индуцирует продукцию декапреноксантина в C. glutamicum , и наши результаты подтверждают это (рис. 13B). K. rhizophila продуцирует декапреноксантин независимо от условий освещения (рис. 13C). Оба Clip185 / Microbacterium и Kocuria относятся к подотряду Micrococcineae под отрядом Actinomycetales. Это показывает, что регуляция продукции декапреноксантина у близкородственных актинобактерий может различаться.CrtR является регулятором транскрипции в семействе MarR, который репрессирует транскрипцию гена crtE (рис. 11) в темноте у представителей Micrococcales и Corynebacteriales. ¹⁹ Было бы интересно проверить, присутствует ли и / или изменен ли ген CrtR в Clip185 по сравнению с геном C. glutamicum ¹⁹ (фиг. 13A-B) после того, как мы секвенировали весь геном Clip185.

Вторичный метаболизм происходит у бактерий во время стационарных фаз роста, когда запас энергии и углерода отвлекается от производства биомассы на производство вторичных метаболитов, таких как антибиотики, каротиноиды и т. Д. ⁷⁶ Производство пигмента можно регулировать, изменяя источники углерода и азота, а также концентрацию солей в питательной среде. ⁷⁷ В будущем мы хотели бы протестировать различные источники углерода и азота и концентрации солей, чтобы увидеть, сможем ли мы создать питательную среду, которая повысит выработку декапреноксантина в стационарной фазе.

Каротиноиды помогают подавлять активные формы кислорода (АФК), которые образуются в абиотических стрессовых условиях. Насколько нам известно, имеется очень мало информации о функциональной роли декапреноксантина в борьбе с определенными типами абиотических стрессов.Рост Clip185 можно контролировать спектрофотометрически в оптимизированной питательной среде в различных стрессовых условиях, генерирующих АФК (например, при сильном освещении, в присутствии АФК, таких как перекись водорода, или одиночных генераторов кислорода, таких как Бенгальский розовый; УФB-свет; солевой и температурный стресс, стресс тяжелых металлов. так далее.). Результаты этих экспериментов могут пролить свет на специфические стрессы, которые стимулируют биосинтез декапреноксантина в бактериях, и могут найти применение для улучшения производства декапреноксантина в коммерческих масштабах.

В настоящее время геномная база данных NCBI содержит 293 геномных сборок Microbacterium из экологических изолятов без достоверно опубликованного названия вида (последнее обращение к 8-26-2021). Ближайшими родственниками Clip185 являются два штамма Microbacterium , данные полного генома которых не доступны в NCBI на момент написания. Род Microbacterium содержит виды, которые имеют очень похожие последовательности гена 16S рРНК и которые трудно идентифицировать на уровне видов, просто основываясь на последовательностях гена 16S рРНК. ¹³

Из-за ограничений финансирования на момент подачи этой рукописи мы не смогли секвенировать весь геном Clip185. Осенью 2021 года мы получим финансирование на полное секвенирование генома Clip185. Clip185 показал различия в чувствительности к антибиотикам и толерантности к тяжелым металлам по сравнению с другими изолятами Microbacterium из загрязненной металлами почвы и в клинических условиях. ^{27 , 49} Эти наблюдаемые различия могут происходить из-за различий между конкретными экологическими нишами, из которых были изолированы эти бактериальные штаммы.Сравнительный анализ полногеномной последовательности различных изолятов микробактерий из окружающей среды с изолятами Clip185 покажет нам важность экологической ниши в формировании генетического разнообразия вида в дополнение к прояснению его таксономической идентичности.

Доступность данных

Базовые данные

Коллекция культур NRRL ARS: Clip185 / Microbacterium binotii вариант штамма PK1-12M; Регистрационный номер: B-65609.

NCBI GenBank: Microbacterium binotii вариант штамма PK1-12M; Ген рибосомной РНК 16S, частичная последовательность, номер доступа MN633284.1: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN633284.1.

Figshare: данные о чувствительности к антибиотикам бактериального штамма Clip185 / Microbacterium binotii , штамм PK1-12M, вариант (инвентарный номер: MN633284.1) и Chlamydomonas reinhardtii , штамм 4A + по результатам диско-диффузионных тестов на чувствительность к антибиотикам, https: // doi. org / 10.6084 / m9.figshare.14668914. ³⁵

Этот проект содержит следующие базовые данные:

• • Дополнительные данные S1 (XLSX).Содержит средние значения и стандартные отклонения зон задержки роста Clip185 и Chlamydomonas на планшетах с ТАР, содержащих антибиотик.

• • Дополнительные данные S2 (XLSX). Статистический анализ зон подавления роста штаммов бактерий Clip185 и Chlamydomonas , индуцированных пятью антибиотиками.

Figshare: изображение чашки LB с отдельными колониями штамма Clip185 / Microbacterium binotii , вариант PK1-12M (номер доступа: MN633284.1), https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14669214. ³⁴

Этот проект содержит отдельные колонии Clip185 Clip185 / Microbacterium binotii , вариант штамма PK1-12M (номер доступа: MN633284.1) на пластине LB.

Figshare: изображения роста Clip185 / Microbacterium binotii штамма PK1-12M (номер доступа: MN633284.1) на картофельном агаре с декстрозой (PDA) и агаре Мюллера-Хинтона (MHA), https://doi.org/ 10.6084 / m9.figshare.14669397. ³⁷

Этот проект содержит изображение, на котором показан рост Clip185 на картофельном агаре с декстрозой (PDA) и агаре Мюллера-Хинтона (MHA).

Figshare: Изображение геля ДНК-агарозы, показывающее электрофоретический анализ продуктов ПЦР, полученных с использованием специфичных для гена праймеров 16S рРНК на геномной ДНК Clip185 / Microbacterium binotii штамма PK1-12M (номер доступа: MN633284.1), https : //doi.org/10.6084/m9.figshare.14669400. ⁴²

Этот проект содержит одно изображение геля ДНК-агарозы, на котором показан анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза ДНК-агарозного геля продуктов ПЦР, полученных с использованием специфичных для гена праймеров 16S рРНК на варианте PK1-12M штамма Clip185 / Microbacterium binotii (номер доступа: MN633284.1) геномная ДНК.

Figshare: Изображение роста варианта PK1-12M штамма Clip185 / Microbacterium binotii (номер доступа: MN633284.1) на пластине LB, содержащей 10 мМ шестивалентного хрома (Cr ⁶⁺ ), https: // doi. org / 10.6084 / m9.figshare.14669421. ⁴⁸

Этот проект содержит одно изображение 10 мМ шестивалентного хрома (Cr ⁶⁺ ), содержащего пластину со средой LB, на которой находится вариант штамма PK1-12M штамма Clip185 / Microbacterium binotii (номер доступа: MN633284.1) наносили штрихами и инкубировали в течение 90 дней для анализа роста.

Данные доступны в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC-BY 4.0).

Запасы углерода в основных типах землепользования / растительного покрова в суб-водоразделе Гадеса, восточная Эфиопия | Углеродный баланс и управление

1.

Лал Р. Управление почвами и экосистемами для уменьшения антропогенных выбросов углерода и повышения глобальной продовольственной безопасности. Биология. 2010; 60: 708–21.

Артикул Google ученый

2.

IPCC. Сельское хозяйство в смягчении последствий изменения климата. Вклад Рабочей группы III в четвертый оценочный доклад международной группы экспертов по изменению климата. Нью-Йорк: издательство Кембриджского университета; 2007.

3.

Международное энергетическое агентство (МЭА). CO ₂ выбросы от сгорания топлива, выделите; 2015. http://www.iea.org/t&c. По состоянию на 23 ноября 2016 г.

4.

Лал Р. Проблемы и возможности исследования органического вещества почвы. Eur J Soil Sci.2009. 60: 158–69.

CAS Статья Google ученый

5.

Стин М. Выбросы парниковых газов от энергосистем, работающих на ископаемом топливе. Объединенный исследовательский центр Европейского Союза, EUR 19754 EN; 2000. http://www.jrc.nl. По состоянию на 14 февраля 2018 г.

6.

Йихенев Г.С., Гетачью А. Влияние различных систем землепользования на отдельные физико-химические свойства почв на северо-западе Эфиопии. J Agric Sci. 2013. 5 (4): 112–20.

Google ученый

7.

Берри Н. Вся ферма Учет углерода мелкими землевладельцами, урок из плана Презентация проекта Vivo на маломасштабном семинаре по учету всей фермы и ландшафта. ФАО, Рим, 27–28 октября 2011 г. www.fao.org/climatechnage/micca/72531/en/.

8.

Гирмей Дж., Сингх Б.Р., Митику Х., Борресен Т., Лал Р. Запасы углерода в эфиопских почвах в связи с землепользованием и управлением почвами.J Land Degrad Dev. 2008. 19 (4): 351–67.

Артикул Google ученый

9.

Лемених М., Карлтун Э., Олссон М. Динамика органического вещества почвы после обезлесения вдоль хронологической последовательности сельскохозяйственных полей в южных высокогорьях Эфиопии. Agr Ecosyst Environ. 2005; 109: 9–19.

Артикул Google ученый

10.

Melero S, López BR, López BL, Muñoz RV, Moreno F, Murillo JM.Долгосрочное влияние обработки почвы, севооборота и азотных удобрений на качество почвы в средиземноморском вертисоле. Обработка почвы Res. 2011; 114: 97–107.

Артикул Google ученый

11.

Йешанев А., Зеч В., Гуггенбергер Г., Текалигн М. Агрегация почвы, а также общее количество органических веществ и твердых частиц после преобразования естественных лесов в непрерывное культивирование в Эфиопии. Обработка почвы Res. 2007; 94: 101–8.

Артикул Google ученый

12.

Лал Р. Повышение урожайности сельскохозяйственных культур в развивающихся странах за счет восстановления запасов органического углерода почвы на сельскохозяйственных землях. Land Degrad Dev. 2006. 17: 197–209.

Артикул Google ученый

13.

Липпер Л., Невес Б., Уилкс А., Теннигкети Т., Гербер П., Хендерсон Б., Бранка Г., Манн В. Финансирование смягчения последствий изменения климата для мелкого сельского хозяйства: руководство по получению выгоды от связывания углерода в почве. Рим: ФАО; 2011 г.

Google ученый

14.

Пан Г., Смит П., Пан В. Роль органического вещества почвы в поддержании продуктивности и стабильности урожайности зерновых в Китае. Сельское хозяйство Ecosyst Environ. 2009. 129: 344–8.

Артикул Google ученый

15.

Райт А.Л., с отличием. Связывание углерода и азота и агрегация почвы при выращивании сорго. Биол плодородные почвы.2005. 41: 95–100.

CAS Статья Google ученый

16.

Дон А., Шумахер Дж., Фрайбауэр А. Влияние изменений в землепользовании в тропиках на запасы органического углерода в почве — метаанализ. Glob Change Biol. 2011; 17: 1658–70.

Артикул Google ученый

17.

Международная группа экспертов по изменению климата (МГЭИК). Изменение климата. Основы физических наук; 2013. http: // www.Climatechange2013.org/images/report/WG1AR5_ALL_FINAL.pdf. По состоянию на 18 февраля 2016 г.

18.

Janzen HH. Круговорот углерода в земных системах — перспектива почвоведения. Agr Ecosyst Environ. 2004. 104: 399–417.

CAS Статья Google ученый

19.

Lasco RD. Балансы углерода в лесах в Юго-Восточной Азии после лесозаготовок и изменения земного покрова. Научный Китай (серия C). 2002; 45: 55–64.

Артикул Google ученый

20.

Vagen TG, Lal R, Singh BR. Связывание углерода в почве в Африке к югу от Сахары: обзор. Land Degrad Dev. 2005; 16: 53–71.

Артикул Google ученый

21.

Доусон Дж., Смит П. Потери углерода из почвы и их последствия для управления землепользованием. Sci Total Environ. 1997. 382: 165–90.

Артикул Google ученый

22.

Лал Р. Лесные почвы и связывание углерода.Для Ecol Manag. 2005; 220: 242–58.

Артикул Google ученый

23.

Гуйбинь В., Велхам К., Фенг С., К. Л., Цао Фулян. Повышенное хранение углерода в почве при агролесоводстве и облесении в субтропическом Китае. Леса. 2015; 6: 2307–23.

Артикул Google ученый

24.

Дену Д., Платтс П.Дж., Келбесса Э., Голе Т.В., Марчант Р. Роль традиционного управления кофе в сохранении лесов и хранении углерода в нагорье Джимма, Эфиопия.Для средств к существованию деревьев. 2016; 25 (4): 226–38.

Артикул Google ученый

25.

Фрайбауэр А., Раунсевелл М., Смит П., Верхаген А. Связывание углерода в сельскохозяйственных почвах Европы. В: Пит Смит, 2004. Связывание углерода пахотными землями: потенциал в Европе и в мире. Eur J Agronomy. 2004. 20: 229–36.

Артикул Google ученый

26.

Negasa B, Zewdu T, Gessa A.Потенциал поглощения углерода полузасушливыми пастбищами при традиционных методах управления в Борана, Южная Эфиопия. Agr Ecosyst Environ. 2016; 223: 108–14.

Артикул Google ученый

27.

Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций / Международный институт прикладного системного анализа / Международный справочно-информационный центр по почвам / Институт почвоведения-Китайская академия наук / Объединенный исследовательский центр Европейской комиссии (FAO / IIASA / ISRIC / ISSCAS / JRC).Гармонизированная всемирная база данных о почвах (версия 1.2), Рим; 2012.

28.

Хайриа К., Ситомпул С.М., Нордвейк М.В., Палм, К. Методы отбора проб запасов углерода над и под землей; 2001. http://www.icraf.cgiar.org/sea.

29.

Iqbala S, Tiwari SC. Высотные колебания запасов органического углерода в почве в Аханакмаре. Int J Curr Res. 2015; 7 (05): 15885–90.

Google ученый

30.

Pearson TR, Brown SL, Birdsey RA.Руководство по измерению поглощения лесного углерода. Вашингтон, округ Колумбия: Лесная служба Министерства сельского хозяйства США; 2007. https://doi.org/10.2737/NRS-GTR-18.

Книга Google ученый

31.

Негаш М., Старр М., Каннинен М., Берхе Л. Аллометрические уравнения для оценки надземной биомассы Coffea arabica L., выращенного на откосах Рифт-Валли в Эфиопии. Agrofor Syst. 2013; 87: 953–66.

Артикул Google ученый

32.

Сантантонио Д., Германн Р.К., Овертон В.С. Исследования корневой биомассы в лесных экосистемах. Педобиология. 1997; 17: 1–31.

Google ученый

33.

Мулугета Л., Итанна Ф. Запасы и оборот углерода в почве в различных типах растительности и пахотных землях вдоль градиента высот на юге Эфиопии. Геодермия. 2004. 123: 177–88.

Артикул Google ученый

34.

Ehrenbergerová L, Cienciala E, Kučera A, Guy L, Habrová H.Запасы углерода на кофейных плантациях агролесоводства с деревьями разных оттенков в Вилья-Рика, Перу. Agrofor Syst. 2016; 90: 433–45.

Артикул Google ученый

35.

Абера Г., Вольде-Мескель Э. Свойства почв и запасы почвенного органического углерода тропических андозолей при различных видах землепользования. Откройте J Soil Sci. 2013; 3: 153–62.

Артикул Google ученый

36.

Нопонен М. Р., Хаггар Дж. П., Эдвардс-Джонс Дж., Хили Дж. Р..Интенсификация кофейных систем может повысить эффективность механизмов REDD. Agric Syst. 2013; 119: 1–9.

Артикул Google ученый

37.

Campbell CR, Plank CO. Подготовка растительной ткани для лабораторного анализа. В: Калра Ю.П., редактор. Справочник эталонных методов анализа растений. Бока-Ратон: CRC Press; 1998. с. 37–49.

Google ученый

38.

Van Reeuwijk LP.Методика анализа почвы s . Технический документ 9, 6-е издание. Международный почвенный справочно-исследовательский центр; 2002.

39.

Blake GR, Hartge KH. Объемная плотность. В: Klute A, редактор. Методы анализа почвы. Часть 1: физико-минералогические свойства. 2-е изд. Висконсин: Американское агрономическое общество; 1986. стр. 363–82.

Google ученый

40.

Маклин Э. pH почвы и потребность в извести. В: Page AL, et al., редакторы. Методы анализа почвы. Часть 2: химические и микробиологические свойства. 2-е изд. Висконсин: Американское общество почвоведов; 1982. с. 199–224.

Google ученый

41.

Walkley A, Black IA. Изучение метода Дегтярева для определения органического вещества почвы и предлагаемая модификация метода хронического кислотного титрования. Почвоведение. 1934; 37: 29–38.

CAS Статья Google ученый

42.

Бремнер JM, Mulvaney CS. Общий азот в методах анализа почв. В: Страница AL, редактор. Метод анализа почвы, часть 2. Мэдисон: Американское почвенное общество; 1982.

Google ученый

43.

Браун С. Оценка изменения биомассы и биомассы тропических лесов: учебник, т. 134. Рим: Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций; 1997. стр. 20–55.

Google ученый

44.

Кэрнс, Массачусетс, Браун С., Хелмер Э, Баумгарденер, Джорджия. Распределение корневой биомассы в высокогорных лесах мира. Oecologia. 1997; 111: 1–11.

Артикул Google ученый

45.

Doetterl S, Kearsley E, Bauters M, Hufkens K, Lisingo J, Baert G, et al. Надземные и подземные накопления углерода в тропических лесах африканских низменностей: движущие силы и последствия. PLoS ONE. 2015; 10 (11): e0143209. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0143209.

CAS Статья Google ученый

46.

Армейн РБ, Габон FM. Биомасса, содержание органического углерода и минеральных веществ абаки ( Musa textilis Nee) на разных стадиях роста. Ind Crops Prod. 2008; 28: 340–5.

Артикул Google ученый

47.

Чжан Ю., Чжао Ю.К., Ши XZ, Лу XX, Ю. Д.С., Ван Х.Дж., Сан В.Х., Дарилек Дж.Л. Вариации оценок органического углерода в почве в горных регионах: тематическое исследование из Юго-Западного Китая.Геодермия. 2008. 146: 449–56.

CAS Статья Google ученый

48.

Адеджувон Дж.О., Эканаде О. Сравнение свойств почвы при различных типах землепользования в части нигерийского какао-пояса. Катена. 1988. 15: 319–31.

Артикул Google ученый

49.

Абате Н., Кибрет К. Влияние землепользования, глубины и топографии почвы на физико-химические свойства почвы вдоль топоследовательности в массиве Вадла-Деланта, Северо-центральное нагорье Эфиопии.Загрязнение окружающей среды. 2016; 5: 2.

Артикул Google ученый

50.

Эллерброк Р., Герке Х. Характеристика состава органического вещества почвы в образцах верхнего и нижнего слоев почвы из коллювиальных и эродированных участков. ZALF, Inst. исследований почвенного ландшафта, Мюнхеберг, Германия. Аннотации геофизических исследований. 2013; 15.

51.

Fantaw Y, Ledin S, A Abdu. Изменения в почвенном органическом углероде и общем содержании азота в трех смежных типах землепользования в горах Бале, на юго-востоке высокогорья Эфиопии.Для Ecol Manag. 2007; 242: 337–42.

Артикул Google ученый

52.

Нигасси Т. Динамика землепользования / почвенного покрова, характеристика почв и многокритериальный метод принятия решений на основе ГИС оценка пригодности земли в водоразделе Вачача, центральное нагорье Эфиопии. Докторская диссертация, Университет Харамая; 2017. с. 169.

53.

Гебрекидан Х., Йитбарек Т., Кибрет К., Бейен С. Воздействие землепользования на отдельные физико-химические свойства почв в районе Абобо, западная Эфиопия.Сельское хозяйство для рыб. 2013. 2 (5): 177–83.

Google ученый

54.

Абате Н., Кибрет К., Гебрекидан Х., Эсайяс А. Характеристика и классификация почв вдоль топосеквора в массиве Вадла Деланта, на севере центральной возвышенности Эфиопии. J Ecol Nat Environ. 2014; 6 (9): 304–20.

Артикул Google ученый

55.

Фейисса С. Характеристика, классификация и пространственная изменчивость состояния плодородия почвы при различном землепользовании / почвенном покрове в водоразделе Фугнан Димо, Западный Харарге региона Оромия.Докторская диссертация, Университет Харамая; 2017. с. 186.

56.

Jones CA. Влияние текстуры почвы на критическую насыпную плотность для роста корней. Soil Sci Soc Am J. 1983; 47: 1208–11.

Артикул Google ученый

57.

Эмиру Нега, Гебрекидан Хелуф. Влияние изменений в землепользовании и глубины почвы на органическое вещество почвы, общий азот и содержание доступного фосфора в почвах в водоразделе Сенбат, Западная Эфиопия.ARPN J из Agric Biol Sci. 2013; 8 (3): 206–12.

Google ученый

58.

Сото Б., Диазфьерроз Ф. Взаимодействие между продуктами выщелачивания золы растений и почвой. Int J Wildland Fire. 1993; 3: 207–16. https://doi.org/10.1071/WF9930207.

Артикул Google ученый

59.

Tekalign T. Анализ почвы, растений, воды, удобрений, навоза и компоста. Рабочий документ № 13. Аддис-Абеба: Международный исследовательский центр животноводства в Африке; 1991 г.

60.

Лэндон Дж. Р., редактор. Букерское руководство по тропическим почвам: руководство по обследованию почв и оценке сельскохозяйственных земель в тропиках и субтропиках. Длинный человек научно-технический. Нью-Йорк: Букер Тейт Лтд., Вили; 2014.

Google ученый

61.

Эяю М., Хелуф Дж., Текалийн М., Мохаммед А. Влияние изменений в землепользовании на отдельные свойства почвы в водосборе ТераГедам и прилегающих агроэкосистемах, Северо-Запад Эфиопии.Эфиоп Дж. Нат Ресур. 2009. 11 (1): 35–62.

Google ученый

62.

Моджири А., Азиз Х.А., Рамаджи А. Возможное снижение характеристик качества почвы в результате изменения землепользования на склоне холма в Лордегане, Западный Иран. Afr J Agric Res. 2012. 7 (4): 577–82.

Google ученый

63.

Мулугета Л., Карлтун Э., Олссон М. Оценка реакции химических и физических свойств почвы на обезлесение и последующее культивирование в системе мелких фермерских хозяйств в Эфиопии.Сельское хозяйство Ecosyst Environ. 2005; 105: 373–86.

Артикул Google ученый

64.

Тайе К. Химические свойства почв дикорастущих кофейных лесов в Эфиопии и последствия для управления. Agric Sci. 2011; 2 (4): 443–50.

Google ученый

65.

Хейзелтон П., Мерфи Б. Интерпретация результатов испытаний почвы: что означают все числа ?. 2-е изд. Сидней: CSIRO Publishing; 2007.

Google ученый

66.

Сильный WM, Мейсон MG. Азот. В: Певерилл К.И., Воробей Л.А., Reuter DJ, редакторы. Анализ почвы: пособие по толкованию. Мельбурн: CSIRO Publishing; 1999.

Google ученый

67.

Grüneberg E, Schöning I, Kalko EK, Weisser WW. Региональная изменчивость запасов органического углерода: сравнение между приращениями глубины и горизонтами почвы. Геодермия. 2010; 155: 426–33.

Артикул Google ученый

68.

Sharma V, Hussain S, Sharma KR, Arya VM. Лабильные углеродные пулы и запасы почвенного органического углерода в предгорных Гималаях при различных системах землепользования. Геодермия. 2014; 232–234: 81–7.

Артикул Google ученый

69.

Ван И, Фу Б., Лю Й, Сонг К., Луан Ю. Пространственная изменчивость почвенного органического углерода и его запасов в холмистой зоне Лессового плато, Китай. Quat Res. 2010. 73: 70–6.

CAS Статья Google ученый

70.

Задорова Т., Пенижек В., Вашат Р., Жижала Д., Чуман Т., Ванек А. Коллювиальные почвы как резервуар почвенного органического углерода в различных почвенных регионах. Геодермия. 2015; 253–254: 122–34.

Артикул Google ученый

71.

Всемирный банк. Проект устойчивого управления земельными ресурсами, документ об оценке проекта (PAD), Эфиопия / Отчет № 42927-ET, Project I.D P107139; 2008. http://www-wds.worldbank.org/external/projects/. По состоянию на 14 февраля 2018 г.

72.

Лал Р., Кимбл Дж. М., Фоллет Р. Землепользование и запасы углерода почвы в наземных экосистемах. В: Лал Р., Кимбл Дж. М., Фоллет Р., редакторы. Управление связыванием углерода в почвах. Нью-Йорк: CRC Press; 1997.

Google ученый

73.

Наир ПКР, Наир В.Д., Кумар Б.М., Соломон Г.Х. Связывание углерода в почве в системах тропического агролесоводства: оценка осуществимости. Политика Environ Sci. 2009; 12: 1099–111.

CAS Статья Google ученый

74.

Федеративная Демократическая Республика Эфиопия (FDRE). Эфиопия — национальный доклад о нейтралитете деградации земель. Аддис-Абеба; 2015.

75.

Ниссен Дж., Темесген Х., Мулугета Л., Зенебе А., Харегевейн Н., Митику Х. Пространственные и временные изменения запасов органического углерода в почве в районе отступления от озера в Эфиопской рифтовой долине. Геодермия. 2008; 146: 261–8.

CAS Статья Google ученый

76.

Риедо М., Гьялистрас Д., фюрер Дж.Чистая первичная продукция и запасы углерода на пастбищах, управляемых по-разному: моделирование чувствительности участков к повышению температуры CO2 и изменению климата. Модель Ecol. 2000. 134 (2–3): 207–27.

CAS Статья Google ученый

77.

Guo LB, Gifford RM. Запасы углерода в почве и изменение землепользования: метаанализ. Glob Change Biol. 2002; 8: 345–60.

Артикул Google ученый

78.

Нордвейк М., Рахаю С., Хайриа К., Вулан Ю.С., Фарида А., Вербист Б. Оценка запасов углерода для ландшафта преобразования леса в кофе в Сумбер-Джая (Лампунг, Индонезия): от аллометрических уравнений к анализу изменений в землепользовании. Научный Китай. 2002. 45: 75–86.

Google ученый

79.

Шмитт-Харш М., Кастелланос Э. Дж., Эванс Т. П., Рэндольф Дж. С.. Запасы углерода в кофейных агролесах и смешанных сухих тропических лесах в западных высокогорных районах Гватемалы.Agrofor Syst. 2012; 86: 141–57.

Артикул Google ученый

80.

Бьюкет В., Строоснийдер Л. Влияние агроэкологической сукцессии землепользования на свойства почвы в водоразделе Чемога, бассейн Голубого Нила, Эфиопия. Геодермия. 2003; 111: 85–98.

CAS Статья Google ученый

81.

Houghton RA, Hackler JL. Изменения в наземных хранилищах углерода в Соединенных Штатах: роль сельского и лесного хозяйства.Glob Ecol Biogeogr. 2000; 9: 125–44.

Артикул Google ученый

82.

Соломон Д., Фриче Ф., Леманн Дж., Текалин М., Зех В. Динамика органического вещества почвы в субгумидных агроэкосистемах Эфиопского нагорья: данные по естественному содержанию 13C и фракции частиц. Soil Sci Soc Am J. 2002; 66: 969–78.

CAS Статья Google ученый

83.

Shrestha RK, Ladha JK, Gami SK.Общий и органический углерод почвы в системах земледелия Непала. Нутр Цикл Агроэкосист. 2006. 75: 257–69.

CAS Статья Google ученый

84.

Аллен Д.Е., Прингл М.Дж., Пейдж К.Л., Далал Р.С. Обзор схем отбора проб для измерения содержания органического углерода в почве на пастбищах Австралии. Пастбищные угодья Дж. 2010; 32: 227–46.

Артикул Google ученый

85.

Хэгер А.Влияние управления и разнообразия растений на хранение углерода в системах агролесоводства кофе в Коста-Рике. Agrofor Syst. 2012; 86: 159–74.

Артикул Google ученый

86.

Харпер Р.Дж., Тиббетт М. Скрытый органический углерод в глубоких минеральных почвах. Почва растений. 2013; 368: 641–8.

CAS Статья Google ученый

87.

Фейиса А., Сормесса Т., Аргоу М. Запасы углерода в лесах и их изменение по высотным градиентам в лесу Эгду: значение управления лесами для смягчения последствий изменения климата.Sci Technol Arts Res J. 2013; 2 (4): 40–6.

Артикул Google ученый

88.

Йоханнес Х., Соромесса Т., Аргоу М. Анализ запасов углерода вдоль высотного градиента в лесу Гедо: последствия для управления лесами и смягчения последствий изменения климата. Am J Environ Prot. 2015; 4 (5): 237–44.

CAS Статья Google ученый

89.

Gedefaw M, Soromessa T, Belliethathan S.Запасы углерода в древесных растениях леса Тара Гедам: значение для смягчения последствий изменения климата. Sci Technol Arts Res J. 2014; 3 (1): 101–7.

Артикул Google ученый

90.

Нега М., Сормесса Т., Байабл Е. Зарезервированный углерод над и под землей в общинном лесу Данаба в регионе Оромия, Эфиопия: значение для баланса выбросов CO ₂ . Am J Environ Prot. 2015; 4 (2): 75–82.

Артикул Google ученый

91.

Тура Т., Аргав М., Эшету З. Оценка накопления углерода в церковных лесах: значение для управления церковным лесом с целью сокращения выбросов углерода. В: Леал Филхо В., Маннке Ф., Мохи Р., Шульте В., Сурруп Д., редакторы. Климатические технологии. Берлин: Управление изменением климата; 2013. с. 403–14.

Глава

Google ученый

92.

Гиббс Х.К., Браун С. Географическое распределение запасов углерода древесной биомассы в тропической Африке: обновленная база данных за 2000 год; 2007 г.https://doi.org/10.3334/cdiac/lue.ndp055.2007.

93.

Пибумрунг П., Гаясени Н., Попан А. Профили запасов углерода в лесах, лесовосстановительных и сельскохозяйственных угодьях, Северный Таиланд. J для Res. 2008. 19 (1): 11–8.

CAS Статья Google ученый

94.

Демесси А., Сингх Б.Р., Лал Р., Бёрресен Т. Опадание листовой подстилки и разложение подстилки под эвкалиптовыми и хвойными насаждениями в районе Гамбо, Южная Эфиопия.Acta Agric Scand Sect B Plant Soil Sci. 2012; 62: 467–76.

Google ученый

95.